《Neurobiology of Disease》：Evidence for hippocampal globotriaosylceramide (Gb3) accumulation and spatial memory impairment in a mouse model of Fabry disease
法布里病（FD）是一种X连锁溶酶体贮积症，由GLA基因致病性变异引起，该变异降低α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）活性，导致球蛋白三糖神经酰胺（Gb3）及相关糖鞘脂进行性蓄积。在人类大脑中，Gb3沉积主要报道于小脑血管内皮，并与脑血管功能障碍、癫痫发作、认知障碍及神经精神症状相关。在实验动物模型中，其区域分布、细胞定位及其与认知功能障碍的关系尚不完全明确，且似乎因物种、模型、恬龄、疾病严重程度及检测方法而异。本研究中，研究人员利用α-半乳糖苷酶A半合子敲除小鼠（α-Gal A?/0）和免疫荧光技术，对海马Gb3免疫反应性进行了区域性和细胞类型特异性表征，并评估了海马依赖性空间学习和记忆。与野生型对照（α-Gal A+/0）相比，α-Gal A?/0小鼠海马Gb3免疫反应性显著增加，沉积主要定位于血管内皮细胞，且毛细血管腔内频繁出现信号。神经元Gb3信号在齿状回门区具有苔状细胞样形态的神经元中检测到。Gb3未与星形胶质细胞（GFAP）或小胶质细胞（Iba1）标志物重叠，尽管星形胶质细胞终足和活化的小胶质细胞常紧贴Gb3阳性血管。同时，α-Gal A（?/0）小鼠Morris水迷宫获取受损，探测试验中空间记忆降低，而游泳速度或距离无变化。这些数据表明，α-Gal A缺乏与海马Gb3免疫反应性增加（主要在神经血管腔室）以及可测量的空间记忆受损相关。
法布里病（FD）是一种X连锁代谢障碍，由GLA基因（Xq22）变异引起，该变异降低α-半乳糖苷酶A（α-Gal A；EC 3.2.1.22）活性，导致多种组织中球蛋白三糖神经酰胺（Gb3）及其脱酰基衍生物球蛋白三糖鞘氨醇（lyso-Gb3）的溶酶体积蓄，包括肾脏、心脏和神经系统。临床上，FD是一种多系统疾病，特征为神经性疼痛、血管角质瘤、角膜漩涡状病变、少汗以及进行性肾脏和心脏受累。中枢神经系统表现常见，多归因于脑小血管病，包括白质异常、腔隙性梗死和缺血性卒中，这些被认为主要由血管底物沉积和内皮功能障碍引起。神经心理学和精神症状——包括认知障碍、抑郁和焦虑——也有报道，但其与血管病理、疼痛负担以及潜在直接实质受累的关系仍较复杂。
死后研究支持FD的脑受累，包括血管细胞中Gb3包涵体的报道，在某些情况下，海马等选定区域的胶质细胞和神经元中也有发现，以及与糖脂沉积相关的杏仁核和下托神经元水肿性肿胀，但无明确的齿状回门区受累。MRI研究报告男性法布里患者海马体积减少，但与显著记忆障碍无直接相关性。因此，由于上述证据，FD中的海马病理应被解释为区域性和临床异质性，而非在患者间均匀分布。
在动物模型中，情况同样存在异质性。实验模型对机制研究具有重要价值，但FD啮齿动物模型并不总是 reproduced人类中枢神经系统表型，且脑中Gb3的分布因模型、年龄和检测方法而异。糖鞘脂代谢的物种差异可能进一步导致Gb3异构体组成和组织分布的差异，潜在限制转化相关性。一个额外的转化限制是α-Gal A缺陷小鼠模型不能再现经典型和迟发型FD之间的临床区别。因此，在α-Gal A（
?/0）模型中获得的结果应被解释为α-Gal A缺乏的机制性后果，而非所有人类法布里表型的直接关联。此外，仍需明确这些沉积是否足以破坏海马依赖性认知功能。解决这一问题对于区分模型的真正局限性与检测脑糖鞘脂的方法学变异性，以及确定局部细胞分布而非总体底物负荷是否是FD认知易感性的决定因素至关重要。在α-Gal A（
?/0）小鼠中，Gb3蓄积在外周组织和感觉神经节中显著，而脑发现范围从血管壁沉积伴有限神经元受累到与转基因或致敏模型中海马功能障碍相关的行为和转录改变。值得注意的是，在雄性和雌性α-Gal A（
?/0）小鼠的前额叶皮层、杏仁核和丘脑的强啡肽能、孤啡肽能和促肾上腺皮质激素释放因子能系统中观察到神经肽基因和蛋白表达的明显失调。行为和分子改变也曾在法布里小鼠模型中报道。因此，未解决的问题并非Gb3蓄积是否可能发生，而是常用的α-Gal A（
?/0）小鼠是否在确定的细胞位点显示海马Gb3免疫反应性，以及这是否与海马依赖性行为障碍相关。
基于这些考虑，本研究旨在验证以下假设：α-Gal A缺乏与海马Gb3免疫反应性在解剖学确定的细胞腔室中相关，并与海马依赖性空间记忆障碍相关。具体目标为：量化α-Gal A（
?/0）小鼠与α-Gal A（
+/0）同胞对照之间海马Gb3免疫反应性；利用共聚焦显微镜和正交Z-stack分析确定Gb3阳性信号与内皮、神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞标志物的关系；以及使用Morris水迷宫测试评估空间学习和记忆。本研究采用的集中实验设计并非旨在系统综述中枢神经系统Gb3分布，而是对广泛应用的小鼠FD模型中海马受累进行细胞分辨率分析。
研究人员使用B6;129Gla-tm1Kul/J品系杂交获得的12-18月龄雄性α-Gal A（
?/0）小鼠及其α-Gal A（
+/0）同胞对照，通过免疫组织化学结合共聚焦显微镜技术，以及Morris水迷宫（MWM）行为学测试开展研究。样本来源为Charles River Laboratories Italia s.r.l.（Jackson Laboratory）提供的种鼠繁殖后代。
研究结果显示，海马Gb3免疫反应性在α-Gal A（
?/0）小鼠中增加。冠状海马切片免疫荧光显示，与α-Gal A（
+/0）对照相比，α-Gal A（
?/0）小鼠Gb3信号显著增加（强度值：α-Gal A（
?/0）= 146.5 ± 16.38 vs α-Gal A（
+/0）= 43.85 ± 17.9，双尾非配对Student's t检验 t = 4.362，df = 10，p < 0.0014；n = 6 each genotype）。
Gb3免疫反应性在α-Gal A（
?/0）小鼠齿状回门区神经元中检测到。为确定海马Gb3信号是否存在于神经元中，研究人员进行了PGP9.5和NeuN双重免疫标记。Gb3和PGP9.5双重标记（α-Gal（
?/0）：n = 6；α-Gal A（
+/0）：n = 6；每动物2-3个切片）显示，在α-Gal A（
?/0）小鼠齿状回门区神经元胞体中存在Gb3阳性免疫反应性，而α-Gal A（
+/0）切片仅显示弱血管信号而无神经元定位。在α-Gal（
?/0）小鼠中，Gb3阳性神经元显示与齿状回多形层苔状细胞一致的形态和分支。然而，由于缺乏特异性分子标志物，门区神经元内的异质性不能排除。因此，这些神经元被称为具有苔状细胞样形态的门区神经元。高倍共聚焦Z-stack和三维重建表明，Gb3阳性结构局限于胞体。Gb3和NeuN双重免疫反应性显示，在海马切片中两种信号无直接重叠（α-Gal（
?/0）：n = 6；α-Gal A（
+/0）：n = 6；每动物2-3个切片），尽管存在明显的Gb3聚集体。在海马检查区域，Gb3点状结构紧邻NeuN阳性胞体，但不与核标志物重叠，指示可能的细胞内腔室。
Gb3免疫反应性不与星形胶质细胞或小胶质细胞标志物重叠，但经常与海马微血管相关。为评估Gb3信号是否与星形胶质细胞重叠，切片进行了GFAP标记。尽管Gb3信号在α-Gal（
?/0）小鼠中比α-Gal A（
+/0）小鼠更显著，但在任一基因型中均未检测到与GFAP的重叠（α-Gal（
?/0）：n = 6；α-Gal A（
+/0）：n = 6；每动物2-3个切片）。Gb3阳性结构频繁定位于海马毛细血管，GFAP阳性星形胶质细胞过程常包裹这些血管，与星形胶质细胞终足对血脑屏障的贡献一致。值得注意的是，Gb3信号在某些毛细血管的整个直径上和血管腔内均可观察到，表明Gb3免疫反应性不限于内皮壁。小胶质细胞通过Ionized calcium-binding adapter molecule 1（ Πba1）抗体检测。在α-Gal A（
?/0）小鼠中，众多Iba1阳性细胞显示活化形态，过程朝向Gb3阳性血管定向（α-Gal A（
?/0）n = 6；α-Gal A（
+/0）：n = 6；每动物2-3个切片）。然而，Gb3信号不与Iba1重叠，表明在这些条件下小胶质细胞不是主要储存腔室。
α-Gal A（
?/0）小鼠海马微血管内皮相关Gb3阳性结构。为检测Gb3阳性结构是否与海马毛细血管相关，切片进行了ERG和CD31共标记。ERG用于识别内皮核，而CD31/PECAM-1用于描绘血管轮廓和内皮细胞边界。在α-Gal（
?/0）小鼠中，共聚焦Z-stack显示Gb3阳性结构围绕ERG免疫反应性内皮核，但无ERG/Gb3清晰信号重叠，表明核周或细胞质/细胞器内皮相关定位。与CD31的共标记显示，在α-Gal（
?/0）小鼠中Gb3阳性信号与CD31阳性血管壁对齐（α-Gal（
?/0）：n = 6；α-Gal A（
+/0）：n = 6；每动物2-3个切片）。正交平面三维重建确认了Gb3阳性结构沿毛细血管壁的模式，在某些情况下延伸至腔内的模式。
α-Gal A（
?/0）小鼠空间学习和记忆功能受损。为检测海马Gb3蓄积是否与空间学习和记忆受损相关，小鼠接受了MWM评估。在5天获取阶段，测量了逃逸潜伏期、游泳至平台区距离和游泳速度。与α-Gal A（
+/0）对照相比，α-Gal A（
?/0）小鼠显示逃逸潜伏期显著增加（重复测量双因素方差分析主效应：day F(4, 104) = 31.059，p < 0.0001，genotype F(1, 26) = 48.812，p < 0.0001，genotype × day interaction F(4, 104) = 0.765，p = 0.7419）。Tukey事后比较显示第4天（p = 0.002）和第5天（p = 0.02）存在显著基因型差异。关于游泳至平台区距离，观察到day（F(4,104) = 31.96，p < 0.0001）和genotype（F(1, 26) = 20.064，p < 0.00013）的显著效应，无显著genotype × day交互作用（F(4,104) = 1.66，p = 0.164）。Tukey事后比较显示第4天（p = 0.002）和第5天（p = 0.02）存在显著基因型差异。游泳速度重复双因素方差分析显示day（F(4,104) = 2691，p < 0.035）和genotype（F(1,26) = 33.658，p < 0.0001）的显著效应，无显著genotype × day交互作用（F(4,104) = 2.0198，p = 0.087）。Tukey事后比较显示仅第5天存在显著差异（p = 0.05）。
第6天探测试验评估空间记忆保持。与α-Gal A（
+/0）对照相比，α-Gal A（
?/0）小鼠在前平台区花费时间更少（α-Gal A（
?/0）= 18.30 ± 1.964 vs α-Gal A（
+/0）= 24.79 ± 1.431；双尾非配对Student's t检验 t = 2.671，df = 26，p = 0.0129），Gallagher接近分数更高（α-Gal A（
?/0）= 38.48 ± 2.461 vs α-Gal A（
+/0）= 28.54 ± 1.196；t = 3.693，df = 26，p = 0.001），进入前平台象限潜伏期增加（α-Gal A（
?/0）= 10.29 ± 2.422 vs α-Gal A（
+/0）= 2.737 ± 0.347；t = 3.088，df = 26，p = 0.0047），前平台穿越频率降低（α-Gal A（
?/0）= 3 ± 0.52 vs α-Gal A（
+/0）= 6 ± 0.17；t = 3.2，df = 26，p = 0.0036）。总游泳距离和游泳速度无显著基因型差异。
本研究提供了α-Gal A（
?/0）小鼠FD模型中海马受累的趋同解剖学和行为学证据。研究讨论部分指出，主要发现的意义在于神经血管储存模式的主导地位，这与FD患者中枢神经系统主要受累于血管水平的先前报告一致。研究人员强调，神经血管功能障碍可能是FD中海马网络应激的近端驱动因素。关于神经元发现，需谨慎将其转化至人类FD，因为人类死后研究证据有限且不一致。 behavioral结果表明α-Gal A（
?/0）小鼠空间学习和记忆受损，这与临床观察的法布里病患者认知主诉和缺陷相关，但研究也承认与先前Hofmann等报告的差异，强调年龄、任务参数和疾病负担的潜在影响。研究局限性包括：基于免疫反应性的底物量化、缺乏LC-MS/MS互补生化测量、仅定性的细胞定位分析、未直接评估血管功能、血脑屏障通透性或脑血流、解剖分析局限于选定海马切片、未将年龄作为独立变量测试，以及储存、神经炎症和突触/回路功能障碍之间的机制联系尚待建立。
研究结论为：α-Gal A缺乏与海马Gb3免疫反应性增加相关，主要在神经血管腔室，并与空间导航任务中表现受损一致，这种表现与海马功能障碍相符。这种神经血管主导模式反映了人类中枢神经系统法布里病理的关键方面，其特征为脑小血管病、灌注改变和血管底物沉积。此外，现有数据支持α-Gal A（
?/0）小鼠作为研究FD中神经血管机制导致认知功能障碍平台的实用性。然而，鉴于本研究中Gb3检测基于免疫荧光，未来工作应包括正交脂质组学验证、独立抗体确认和神经血管完整性功能评估。
