ADNP综合征老龄小鼠表现出突变/性别依赖的运动行为与昼夜节律性紊乱

《Neurobiology of Disease》：Aging ADNP syndrome mice exhibit mutation/sex-dependent disruption of motor behavior and circadian rhythmicity

　　

昼夜节律紊乱是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）及相关神经退行性疾病的早期且具临床相关性的特征，但其出现的分子决定因素尚未完全阐明。活性依赖性神经保护蛋白（activity-dependent neuroprotective protein, ADNP）是神经发育与神经保护的关键调控因子，其新发突变可导致神经发育性ADNP综合征伴tau蛋白病变，而其体细胞突变则与阿尔茨海默病中的tau蛋白病变及神经退行性变相关，但ADNP在昼夜节律系统功能中的作用尚未得到系统性探索。

鉴于阿尔茨海默病在女性中的患病率约为男性的两倍，研究人员对老龄ADNP紊乱小鼠模型进行了昼夜节律性运动的全面表征，明确将性别作为生物学变量，涵盖了该综合征的两个关键表型。研究人员采用自愿跑轮活动记录结合余弦节律测量法，定量分析了昼夜节律组织的相关参数，包括活动水平、时相和节律完整性。

研究人员证实，ADNP单倍剂量不足伴晚期tau蛋白沉积与昼夜节律组织受损存在强烈性别依赖性关联。在Adnp^+/?小鼠中，昼夜节律改变在雌雄间呈现分化：雄性表现为总体活动水平和节律输出的显著降低，而雌性则表现为昼夜节律时相改变（相位偏移）及波形复杂性增加，提示活动模式碎片化。值得注意的是，两性均观察到节律稳健性下降，表明昼夜节律输出的稳定性受损。

与Adnp^+/?小鼠不同，携带杂合Adnp p.Tyr718*突变（伴早期tau蛋白病变）的小鼠仅在昼夜节律挑战范式下表现出显著易感性。该现象以基于余弦零振幅检测的高节律紊乱发生率为特征，在一小型探索性雄性队列中表现尤为严重，所有受检Tyr718*小鼠均未表现出可检测的昼夜节律性。

重要的是，该研究在老龄小鼠中进行，这一背景与年龄相关性神经退行性易感性密切相关。这些发现将ADNP定位为昼夜节律系统稳定性的贡献因素，并提示其相关信号通路可作为未来机制研究与治疗干预的候选靶点。

本研究发表于《Neurobiology of Disease》，聚焦于ADNP（活性依赖性神经保护蛋白）这一神经发育与神经保护关键调控因子在昼夜节律系统中的作用，旨在填补ADNP与昼夜节律功能关联的研究空白。

**研究背景与问题**

尽管阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的主要遗传贡献因子已被广泛研究，但大多数散发性病例的分子病因仍尚未完全阐明。近年来，体细胞脑突变在疾病进展中的作用受到关注，为AD发病机制增添了基因组与细胞复杂性层面。虽然疾病修饰疗法已进入临床实施阶段，但其疗效有限且存在安全性顾虑，凸显了识别将神经退行性与更广泛的系统功能障碍整合的上游机制的紧迫性。因此，研究重心逐渐扩展至AD前驱期的早期病理生理改变，其中睡眠与昼夜节律调节障碍尤为突出。昼夜节律紊乱是AD最早出现且最稳健的非认知表现之一，且与疾病进展和认知衰退密切相关。更重要的是，昼夜节律紊乱不仅仅是神经退行性变的下游后果——睡眠剥夺可增加脑脊液中Aβ和tau蛋白水平，慢性睡眠碎片化则加速tau蛋白的传播与聚集；昼夜节律失调还可调控蛋白质稳态、氧化应激、线粒体功能、炎症状态及代谢调节等AD发病的核心环节。这支持了双向模型，即昼夜节律功能障碍主动促进疾病进展，而非仅反映神经元丢失。

AD存在显著的性别差异：女性终生患病风险更高、tau蛋白负荷更重、认知衰退更快，这可能反映了激素、免疫、应激相关及衰老相关机制间的相互作用。昼夜节律生理学本身具有性别二态性，受性激素及年龄相关内分泌转换的影响，提示AD中的昼夜节律紊乱可能是衰老、性别特异性生物学与神经退行性应激因素汇聚的结果。

在此背景下，ADNP成为连接应激反应、细胞骨架完整性与tau蛋白病理的引人关注的候选分子。ADNP是大脑发育和神经元存活的关键蛋白，其完全缺失具有胚胎致死性。ADNP体细胞突变与AD脑中的tau蛋白相关病理有关。ADNP具有多种分子功能，包括调控细胞骨架动力学、染色质重塑和细胞应激反应，并受血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）和垂体腺苷酸环化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP）调控且与其功能相互作用，而后两者在昼夜节律调节中发挥核心作用。这些相互作用使ADNP及其相关信号网络成为连接昼夜节律生物学与神经发育及神经退行性过程的有前景的整合靶点。此外，ADNP的新发突变可导致发育性ADNP综合征（亦称Helsmoortel Van Der Aa综合征），该综合征在年轻时期即表现出睡眠问题和AD样tau蛋白病变。

研究人员实验室已构建多种基因工程小鼠模型以探究ADNP的体内功能。Adnp^+/?模型作为完全敲除（胚胎致死）的功能替代模型，表现出可测量的认知缺陷和tau蛋白相关表型，且tau蛋白沉积与衰老相关。另一重要进展是构建了携带杂合Adnp p.Tyr718*突变的小鼠模型，该突变是人类最频发突变p.Tyr719*的直系同源体，表现出发育迟缓、显著的性别依赖性运动和沟通表型、树突棘密度降低、棘形态改变、早期年龄tau蛋白病理以及性别依赖性成年神经发生缺陷。

重要的是，ADNP在分子和系统水平均表现出显著的性别依赖性调控。其表达受性别调控，且ADNP本身调控性激素生物合成基因。ADNP缺乏导致跨尺度的两性异形表型，从树突棘形态和钙信号到感觉处理、运动功能和行为，使ADNP成为神经发育和神经退行性背景下性别特异性易感性的潜在介导因子。尽管已有研究表明海马PACAP（Adcyap1）和PAC1受体（Adcyap1r1）基因表达在Adnp^+/?小鼠模型中以年龄和基因型依赖性方式调控，但ADNP紊乱与昼夜节律的直接测量尚未被检验。鉴于VIP与PACAP信号、应激通路、微管稳定性、衰老相关易感性及tau动力学之间的已确立联系，全面昼夜节律表型分析的缺失构成了该领域的关键空白。基于此，研究人员提出本研究的核心假设：ADNP可能参与昼夜节律的调控或维持昼夜节律系统的韧性。

**研究方法**

本研究采用14–18月龄的ICR背景老龄小鼠，包括Adnp^+/?小鼠、Adnp p.Tyr718*杂合突变小鼠（Tyr718*小鼠）及其 respective 野生型（wild-type, WT）对照。实验前，动物单独饲养并转移至12小时逆转光暗周期适应10天。采用无线跑轮系统连续记录72–120小时的自愿跑轮行为（60分钟分箱），以余弦节律测量法（cosinor-based rhythmometry）分析昼夜节律参数，包括中值估计统计量（mesor）、振幅（amplitude）、光暗周期夹带下的周期（period）、相位（phase）、稳健性（robustness，以决定系数R²表示）和波形复杂性指数（complexity index，基于快速傅里叶变换的谐波分析）。统计采用Welch's t检验。

**研究结果**

研究首先对两种ADNP突变模型进行探索性实验。Tyr718*小鼠的基线队列未显示统计学支持的基因型依赖性改变，故后续聚焦于较大样本的Adnp^+/?小鼠进行稳健表型表征，同时对Tyr718*小鼠采用昼夜节律挑战范式评估潜在的潜在易感性。

在"ADNP单倍剂量不足以性别依赖性方式扰乱昼夜节律性运动与节律稳定性"部分，视觉检查显示Adnp^+/?动物活动模式改变：雌性突变鼠活动模式碎片化增加，雄性突变鼠总体活动降低。余弦分析定量证实：活动相关参数（mesor和amplitude）在雌性中无显著差异，但雄性Adnp^+/?小鼠显著降低；昼夜节律时相参数中，雌性Adnp^+/?小鼠较WT对照出现显著相位偏移，而周期在两性中均接近24小时且无显著差异；节律完整性参数方面，雌性Adnp^+/?小鼠节律稳健性显著降低、波形复杂性指数显著增加（提示活动模式碎片化），雄性Adnp^+/?小鼠同样表现出稳健性下降但波形复杂性无显著差异。

在"昼夜节律挑战揭示Tyr718*小鼠运动节律性丧失"部分，针对Tyr718*小鼠的基线表型缺失，研究人员采用48小时持续黑暗后即刻转入逆转光暗周期且无适应期的挑战范式。视觉检查显示Tyr718*小鼠节律模式紊乱，尤其雄性。余弦零振幅检验（cosinor F-test, p>0.05）显示：雌性中1/4 WT小鼠、4/7 Tyr718*小鼠判定为无节律；雄性中2/5 WT小鼠、3/3 Tyr718*小鼠判定为无节律。因相当比例Tyr718*小鼠丧失显著节律性，未能进行进一步的节律参数估计。

**讨论与结论**

研究表明ADNP紊乱与昼夜节律运动和稳态受损相关，且呈现性别依赖性。Adnp^+/?小鼠的核心发现是昼夜节律输出和节律稳定性参数主要受累，而核心计时属性（周期）基本保留。这提示ADNP紊乱不导致昼夜节律周期的粗大幅改变，而与节律行为的表达和稳定性受损相关。雌性波形复杂性增加指向活动的时间组织破坏，这与衰老和神经退行性疾病中的昼夜节律失调特征一致，具有生物学相关性而非单纯的运动读出改变。

两种突变模型的差异表型提示不同ADNP突变模式可能通过部分分离的分子和细胞通路影响昼夜节律调控，而非代表统一的功能丧失。Tyr718*突变先前被关联至细胞活力降低、核-质完整性破坏、微管完整性受损及更严重的细胞表型，包括微管扰动的易感性增加；而单倍剂量不足则主要关联神经元形态改变。在回路水平，ADNP紊乱与突触可塑性向过度增强和抑制减弱转变相关，这种状态与网络灵活性受损及适应环境扰动能力降低有关。此外，ADNP与VIP和PACAP信号通路的功能联系为这些观察提供了机制框架，这些通路在昼夜节律同步和光夹带中发挥已确立的作用。海马PACAP和PAC1受体基因表达在Adnp^+/?模型中的年龄和基因型依赖性调控也支持了复杂的调控网络。

研究在14–18月龄小鼠中进行，对应实验室小鼠的晚中年至早老年阶段，与年龄相关的神经退行性易感性增加相关，是疾病相关昼夜节律系统功能改变可能被检测到的关键窗口。研究局限性包括：仅采用跑轮活动评估昼夜节律行为，未涵盖睡眠结构或分子节律；光暗条件下的周期估计应解释为夹带状态下的表现周期；Tyr718*挑战实验中可用老龄雄性数量较少，3/3雄性无节律的观察应视为初步结果而非确定性证据，需更大独立队列验证。

研究结论指出，本研究首次系统证实ADNP紊乱与昼夜节律活动稳定性和组织受损相关，以及在性别依赖性方式下对昼夜节律扰动的易感性增加。不同模型中观察到的不同表型谱提示ADNP紊乱的不同模式在整合生理输出水平差异性地影响昼夜节律调控。这些发现将ADNP定位为昼夜节律系统稳定性的贡献因素，为未来旨在阐明其在昼夜节律功能障碍与神经退行性易感性交汇点作用的研究提供了框架。ADNP与昼夜节律稳定性的关联也凸显了其相关通路作为治疗干预潜在靶点的价值，包括ADNP衍生研究药物davunetide的进一步研究方向。