下一代化学遗传学抑制：利用一种可透过血脑屏障的非处方药物

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Next-generation chemogenetic inhibition using a brain-permeant non-prescription agent

　　

化学遗传学允许在给予选择性激活配体后对脑回路进行可控操作，在解析多种行为背后的神经环路机制中具有不可替代的价值。Gαi/o偶联的设计型毒蕈碱受体hM4Di（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs, DREADDs）是一种尤为灵活的按需抑制工具，不仅在基础神经科学中证明有效，还作为治疗性转基因在临床前癫痫及其他中枢神经系统疾病模型中展现出应用前景。确实，通过将环路调控置于外源性配体的控制之下，化学遗传学降低了病毒载体介导基因治疗固有的过量给药风险。然而，临床转化的障碍在于缺乏一种具有良好生物分布特性和安全性特征的激活配体。研究人员在此证明，在hM4Di的两个位点（S85和Y416）进行突变可使广泛使用的非处方抗组胺药苯海拉明（DPH）成为其完全且强效的激动剂。研究人员结合人胚胎肾细胞中的中等通量筛选与神经元环路中的体外电生理特性分析，并利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）揭示苯海拉明与关键残基的相互作用。对表达修饰受体于腹侧海马的小鼠给予苯海拉明，可逆性地调控焦虑相关行为并减轻化学致痫剂诱导的癫痫发作严重程度。研究人员进一步在慢性癫痫模型中证明了按需抑制癫痫发作的效果。由非处方药物激活的G蛋白偶联受体（G protein-coupled Receptors Activated by Non-Prescription Agents, GRANPAs）为这一强效化学遗传学脑回路调控方法的临床转化降低了门槛。

该论文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊，研究人员针对当前化学遗传学工具临床转化面临的核心瓶颈——即缺乏安全、可透过血脑屏障且易于获取的激活配体——开展了系统性研究。现有化学遗传学抑制工具中应用最广泛的为毒蕈碱DREADD家族的hM4Di受体，其传统激活配体氯氮平（CLZ）及类似物虽效力强，但存在显著的多靶点药理学活性和临床安全性问题。为突破这一局限，研究人员以非处方抗组胺药苯海拉明（DPH）为切入点，因其具有已确证的安全性记录和血脑屏障穿透能力，但存在对hM4Di激活效力不足的缺陷。通过对hM4Di受体进行定向突变筛选，研究人员成功获得了高 potency 和高 efficacy 的新型受体变体GRANPA（hM4Di^S85V+Y416F），并与苯海拉明构成新型化学遗传学配对，在分子机制、细胞信号转导、神经元环路功能及在体行为表型等多层面进行了全面验证。

研究采用的关键技术方法包括：基于β- arrestin的PRESTO-Tango（parallel receptorome expression and screening via transcriptional output）高通量筛选体系用于突变体初筛；GloSensor^TM cAMP生物发光检测体系用于定量G蛋白信号通路激活程度；TRUPATH（Translocation Assay for Universal Pathway activation）生物发光共振能量转移（BRET）检测平台用于解析特定Gα亚型偶联及受体脱敏特性；MeNArC（MERLIN-NanoArrestin-CRISPR）检测体系用于β-arrestin招募的精确定量；冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术用于解析受体-配体-G蛋白复合物的近原子分辨率结构；腺相关病毒血清型9（AAV9）载体介导的脑区特异性基因递送；多电极阵列（MEA）记录体外神经元网络电活动；急性海马脑片场兴奋性突触后电位（fEPSP）记录；小鼠开放场行为学测试；戊四氮（PTZ）化学致痫急性癫痫模型；以及海人酸诱导的慢性内侧颞叶癫痫模型伴无线脑电图（EEG）遥测记录。

**突变筛选与GRANPA受体构建**

研究人员基于结构生物学信息进行定向突变筛选。通过比对毒蕈碱M4受体（hM4）与组胺H1受体、M2受体的晶体结构，识别出正构结合口袋（orthosteric binding pocket, OBP）及信号转导通路上的候选突变位点。在PRESTO-Tango检测体系中，S85V突变使苯海拉明的效力提升10倍、 efficacy 增至130%，该突变通过破坏S85与D112、Y443之间的氢键网络，使D112旋转约40°朝向OBP，增强与苯海拉明胺基的相互作用。Y416F突变使效力提升9倍，该位置由酪氨酸变为苯丙氨酸消除了与特定拮抗剂的氢键，同时保留了芳香性盖子结构对配体胺基的阳离子-π相互作用。将S85V与Y416F组合后，在GloSensor检测中展现出约1400倍的效力提升，EC₅₀达到870 pM，且无显著基础活性，被确认为最终GRANPA受体。其他测试的突变包括V120I（增加3x40位点构象刚性）、L123C/T/V（破坏疏水锁增强激活但导致不同程度组成型活性）及F128L/I/V（减弱TM3-TM5相互作用），均因单独或组合后存在组成型活性或提升幅度有限而未采用。

**GRANPA-DPH复合物的冷冻电镜结构解析**

为阐明分子激活机制，研究人员解析了GRANPA与迷你Gαi蛋白（mGαsi）、Gβ1γ2亚基、纳米抗体Nb35及苯海拉明结合的冷冻电镜结构，整体复合物分辨率达2.6 ?，受体聚焦后达3.0 ?。结构明确显示苯海拉明通过三个主要化学基团实现分子识别：胺基与D112形成氢键并嵌入由Y443、Y439和C442构成的疏水口袋；醚氧朝向胞外界面，被F416和W413环绕；两个疏水性芳基占据由G203、W164、V420、F416和L190构成的疏水口袋，其中W164与W413形成π-π堆积以锚定其中一个芳基。与hM4-ACh及hM4Di-DCZ结构比较显示，GRANPA与后两者整体结构高度相似，激活基序保守，主要差异在于TM6的细微外移及G蛋白旋转角度。S85V突变的关键作用在于解除原有氢键约束，使D112得以重新定向与配体胺基相互作用；而Y416F突变虽消除了原有酪氨酸羟基参与的氢键，但苯丙氨酸仍维持疏水环境稳定。

**GRANPA的药理学特征**

研究人员系统比较了GRANPA-DPH与hM4Di-CLZ的信号转导特性。在Gαi2、GαoA、GαoB、Gαz等G蛋白亚型激活方面，GRANPA-DPH的效力约为hM4Di-CLZ的3倍低、 efficacy 低20%-40%。然而，关键优势在于GRANPA-DPH表现出显著降低的Gαs刺激活性及极低的β-arrestin 2招募水平。通过GloSensor cAMP检测发现，GRANPA-DPH对腺苷酸环化酶（AC）的刺激显著低于hM4Di-CLZ；MeNArC检测证实其β-arrestin途径激活微弱。对其他临床可用抗组胺药（如diphenylpyraline、cyproheptadine）的筛选表明，苯海拉明仍是GRANPA最优配体。重要的是，GRANPA对内源性神经递质（乙酰胆碱、组胺、多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺）在100 μM以下浓度均无明显激活，确保了化学遗传学的特异性。通过比较GRANPA-Gαi2激活与H1-Gαq抑制的效力比，估计苯海拉明对GRANPA的激活效力约为H1抑制效力的250倍，提示其治疗窗宽，低剂量激活GRANPA时几乎不引起H1介导的镇静等不良反应。

**神经元环路层面的功能验证**

在体外实验中，研究人员利用AAV9-CaMKII-HA-GRANPA载体（在多电极阵列培养的兴奋性神经元中）验证功能效应。苯海拉明（200 nM）处理1小时后，GRANPA表达网络的加权平均放电率（wMFR）降至基线的37%，网络爆发频率降至35%，而爆发持续时间及每爆发内 spike 数不变。该抑制效应在24小时后消失，提示存在稳态代偿机制，且与hM4Di-CLZ效应模式一致。在急性海马脑片实验中，表达GRANPA的CA1区放射层在苯海拉明（1 μM）灌注后，fEPSP斜率显著降低，而纤维群峰电位幅度不变，证实GRANPA-DPH通过抑制谷氨酸释放而非轴突兴奋性发挥突触前抑制作用，且基础fEPSP斜率与对照无差异，表明受体无基础活性。

**在体行为与癫痫治疗应用**

研究人员在小鼠腹侧海马表达GRANPA后测试焦虑相关行为。苯海拉明（1 mg/kg，腹腔注射）显著增加GRANPA表达小鼠在开放场中的中央区域进入次数，并表现出非依赖性趋势减少趋壁性，同时显著增加非支撑性站立、减少排便颗粒数，综合表明具有抗焦虑效应，且对总运动距离无显著影响，排除镇静作用干扰。在戊四氮急性化学致痫模型中，预先给予苯海拉明显著延长GRANPA表达小鼠首次肌阵挛发作的潜伏期。为评估对自发性癫痫的抑制能力，研究人员构建了海人酸诱导的慢性内侧颞叶癫痫模型，该模型经历癫痫持续状态后进入潜伏期，继而出现高频自发性局灶性发作。在GRANPA双侧海马表达的动物中，苯海拉明或氯氮平（1 mg/kg）而非生理盐水注射显著降低癫痫发作负荷（seizure burden），主要影响发作频率而非持续时间。对照表达mCherry的动物中氯氮平无此效应，证实GRANPA-DPH的特异性抗癫痫作用。

**讨论与结论**

研究人员在讨论部分指出，GRANPA-DPH配对的核心创新价值在于将化学遗传学抑制的临床转化门槛显著降低。与现有hM4Di激活配体相比，苯海拉明作为非处方药物具有无可比拟的安全性优势：其在多个国家作为第一代抗组胺药非处方使用，而氯氮平、奥氮平等抗精神病药物存在血液学不良反应、代谢综合征等严重副作用风险。尽管GRANPA-DPH的绝对效力低于hM4Di-CLZ，但其偏向性信号特征——减少的Gαs刺激和 minimal 的β-arrestin招募——可能补偿了 potency 的不足，且有利于长期治疗的耐受性。β-arrestin介导的受体内化与脱敏是GPCR连续激活后常见的适应现象，GRANPA在此途径的薄弱耦合可能延长有效作用时间。研究还指出，GRANPA的突变位点远离调控受体亚细胞定位的胞内元件，故其突触前/后分布特征预计与野生型M4受体及hM4Di类似。

在剂量换算方面，虽然啮齿类与人类存在药代动力学差异，但产生有效行为与抗癫痫效应的1 mg/kg剂量远低于小鼠运动抑制的剂量（约10倍高）和致死量（LD50约100倍高），提示治疗指数宽。GRANPA-DPH在腹侧海马的抗焦虑效应与该区参与情境恐惧、行为回避及应激决策的环路连接一致；而该区亦为颞叶癫痫的重要发作起始区。双侧海马GRANPA表达在海人酸模型中的抗癫痫效应，对临床治疗双侧颞叶癫痫具有潜在意义——该类患者因手术风险无法接受切除性治疗，化学遗传学提供了一种可调控的替代策略。

研究结论指出：尽管hM4Di仍是基础研究的强大工具，GRANPA-DPH作为一种可由非处方药物激活的化学遗传学配对，是癫痫及其他环路过度兴奋性疾病临床转化的候选方案。化学遗传学方法将基因治疗的区域与细胞类型特异性与剂量可调控的治疗效应相结合，这是单纯调整病毒载体滴度所无法实现的。在进一步验证的前提下，GRANPA-DPH有望相对安全地实现化学遗传学抑制，无论是作为连续性治疗还是按需干预，例如用于控制即将发生的癫痫发作加重、丛集性头痛恶化或精神病性复发等临床场景。