CHCHD2与CHCHD10通过GABARAPs促进蛋白质聚集体的自噬清除

《Autophagy》：CHCHD2 and CHCHD10 promoted autophagic clearance of protein aggregates via GABARAPs

　　

线粒体蛋白CHCHD2（coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2，含卷曲螺旋-螺旋-卷曲螺旋-螺旋结构域2）及其旁系同源物CHCHD10的突变已在帕金森病（Parkinson disease, PD）、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）、额颞叶痴呆（frontotemporal dementia, FTD）及阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）患者中被鉴定。CHCHD2与CHCHD10突变在模式动物中引起类似患者的神经退行性病变，但其病理生理学作用尚不明确。本研究报道了CHCHD2与CHCHD10在自噬中的直接作用。研究人员鉴定了一个由CHCHD2-CHCHD10-C1QBP/p32-Atg8家族蛋白（Atg8-family proteins, ATG8s）组成的蛋白复合物，其中每个分子均相互结合。CHCHD2、CHCHD10和C1QBP/p32优先与ATG8s中的GABARAPs（gamma-aminobutyric acid receptor-associated proteins，γ-氨基丁酸A型受体相关蛋白）结合。疾病相关的CHCHD2和CHCHD10突变表现出与ATG8s不同的相互作用。通过与GABARAPs结合，CHCHD2和CHCHD10发生自噬降解，并招募UNC-51样激酶1（unc-51 like kinase 1, ULK1）复合物。CHCHD2瞬时敲减以及人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源的CHCHD2^?/?或CHCHD2^T61I多巴胺能神经元中出现自噬起始缺陷。重要的是，CHCHD2和CHCHD10促进自噬。CHCHD2减少细胞中的蛋白质聚集体及小鼠纹状体中有毒的SNCA/α-synuclein（突触核蛋白）物种。该研究因此揭示线粒体蛋白CHCHD2和CHCHD10既是自噬底物又是自噬激活因子，为靶向神经退行性疾病患者的治疗奠定了基础。

神经退行性疾病包括帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）和阿尔茨海默病（AD），其特征为神经元丢失伴线粒体功能障碍和蛋白质聚集体。线粒体或蛋白质稳态（proteostasis）的破坏均可导致神经退行性变，但这些致病机制常相互交织，为设计有效干预措施带来挑战。

线粒体蛋白CHCHD2/MNRR1/MIX17B及其旁系同源物CHCHD10/MIX17A与多种神经退行性疾病相关。CHCHD2^T61I突变首次在晚发性常染色体显性PD家族中被鉴定，后续在PD、AD、特发性震颤、FTD及ALS患者中也有发现。CHCHD2与其旁系同源物CHCHD10结合，两者序列同源性达57%。CHCHD10突变则在FTD、ALS、线粒体肌病、腓骨肌萎缩症2型（Charcot-Marie-Tooth disease type 2, CMT2）、Jokela型脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, Jokela type, SMAJ）及PD患者中被鉴定。尽管CHCHD2或CHCHD10突变在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠中引起蛋白质聚集体和神经退行性变，但其潜在生理作用仍不清楚。

作为线粒体蛋白，CHCHD2和CHCHD10位于线粒体内膜间隙，维持线粒体内膜超微结构，调节线粒体应激反应、代谢和凋亡。然而，chch uartiosc-2和chchd10双敲除（double knockout, DKO）小鼠或iPSCs仅表现轻度线粒体缺陷，提示CHCHD2和CHCHD10的线粒体功能在很大程度上是可替代的，其突变所致神经退行性变可能并非源于线粒体功能。此外，CHCHD10聚集体在中脑神经元中于线粒体功能障碍出现之前的幼年Chchd10^S59L小鼠中被发现，提示CHCHD2和CHCHD10可能在其线粒体功能之前即参与蛋白质稳态调节。

CHCHD2和CHCHD10还与C1QBP/p32/gC1qR/HABP1（补体组分1 q亚组分结合蛋白）结合，后者为丰富的线粒体基质蛋白。中枢神经系统特异性c1qbp^?/?小鼠出生8周内死亡并表现退行性表型；心肌细胞特异性c1qbp^?/?小鼠则出现胚胎致死伴自噬异常。本研究旨在探究CHCHD2和CHCHD10在巨自噬（macroautophagy）/自噬-溶酶体通路中的作用。

**CHCHD2和CHCHD10通过溶酶体发生活跃的自噬降解**

研究人员首先检测了CHCHD2、CHCHD10和C1QBP的降解特性。CHCHD2降解迅速，半衰期（t_1/2）≤2小时；CHCHD10半衰期略长于CHCHD2，而C1QBP较为稳定。线粒体蛋白酶敲减或抑制剂处理反而减少CHCHD2和CHCHD10，提示这些线粒体蛋白酶可能更多起稳定而非降解作用。线粒体解偶联剂FCCP诱导PINK1（PTEN诱导推定激酶1）-PRKN/Parkin（帕金森蛋白）依赖性线粒体自噬（mitophagy）时可增强CHCHD2和CHCHD10，提示两者均不被该途径降解。蛋白酶体抑制剂MG132或硼替佐米（bortezomib, BTZ）处理也减少CHCHD2和CHCHD10，且MAP1LC3/LC3（微管相关蛋白1轻链3）-II增强，提示自噬激活而非蛋白酶体降解。进一步实验显示，自噬激活剂torin1、雷帕霉素（rapamycin）、EBSS（Earle平衡盐溶液）营养剥夺或血清饥饿减少CHCHD2；自噬抑制剂渥曼青霉素（wortmannin）、氯喹（chloroquine, CQ）、 bafilomycin A1（bafA1）及亮抑酶肽联合NH₄Cl则增加CHCHD2和CHCHD10，表明两者通过自噬-溶酶体途径降解。利用SNAP标签系统，研究人员观察到CHCHD2-SNAP和CHCHD10-SNAP从细胞质转运至溶酶体标志物LAMP1阳性结构，证明其进入溶酶体降解。

研究人员还观察到部分CHCHD2和CHCHD10存在于细胞质。疾病相关突变CHCHD2^Q126X和CHCHD10^Q108P可完全定位于细胞质。N端和C端均参与线粒体靶向，大型标签如SNAP标签（19.4 kDa）会消除其线粒体定位。亚细胞分级分离证实CHCHD2、CHCHD10和C1QBP同时存在于细胞质和线粒体。尽管CHCHD2与分子伴侣HSPA8/HSC70（热休克蛋白家族A成员8）结合，但LAMP2A敲减、过表达及CMA特异性抑制剂AR-7均不影响CHCHD2水平，排除其为分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy, CMA）底物的可能。

**CHCHD2、CHCHD10和C1QBP独立结合ATG8s**

为寻找解释CHCHD2和CHCHD10自噬-溶酶体通路作用的新互作蛋白，研究人员利用细菌纯化的GST-CHCHD2和GST-CHCHD10进行质谱分析，鉴定到GABARAP肽段。体外蛋白-蛋白相互作用实验显示，His-CHCHD10结合ATG8s，优先结合GABARAPL1和GABARAPL2；His-CHCHD2与GABARAPL1或GABARAPL2有弱相互作用；而His-C1QBP与ATG8s结合最强，优先结合GABARAP、GABARAPL1和GABARAPL2。反向实验中，His-GABARAP被GST-C1QBP强下拉，被GST-CHCHD10弱下拉，而不被GST或GST-CHCHD2下拉。综上，CHCHD2、CHCHD10和C1QBP在体外直接结合ATG8s，优先结合GABARAPs；其中C1QBP结合最强，CHCHD10次之，CHCHD2最弱。

**CHCHD2-CHCHD10-C1QBP中ATG8s潜在结合基序的鉴定**

ATG8s通过LC3相互作用区（LC3-interacting Region, LIR）与靶蛋白结合，共有序列为W/Y/F-x-x-L/I/V。CHCHD2和CHCHD10均含3个α-螺旋：N端α1和C端2个CX₉C基序（CHCH结构域）中的α2-3。研究人员在CHCHD2-α3中鉴定到潜在LIR区域¹³⁷FNEV¹⁴⁰，在CHCHD10-α3后立即区域鉴定到¹³⁵YHGL¹³⁸，在C1QBP中鉴定到2个潜在LIR。

GST下拉实验表明，CHCHD2的潜在LIR ¹³⁷FNEV¹⁴⁰并未贡献于ATG8相互作用；相反，C末端7个氨基酸¹⁴⁵RLAN¹⁴⁸介导了CHCHD2-ATG8相互作用，且该序列对CHCHD2-CHCHD10相互作用也重要。CHCHD10的¹³⁵YHGL¹³⁸则确实介导了CHCHD10-ATG8相互作用。C1QBP的第2个潜在LIR ²³⁶YDHL²³⁹同时介导C1QBP-ATG8和C1QBP-CHCHD10相互作用。因此，145RLAN148（CHCHD2）、135YHGL138（CHCHD10）和236YDHL239（C1QBP）分别为关键的ATG8结合区域。

**CHCHD2-CHCHD10-C1QBP的分子结构**

进一步解析复合物组装方式：N端α-螺旋区的CHCHD2和CHCHD10强结合C1QBP；CHCHD2同源二聚体依赖N端，CHCHD2-CHCHD10异源二聚体通过CHCHD2 C端介导，CHCHD10同源二聚体主要通过C端。这些二聚相互作用远弱于CHCHD2/CHCHD10与C1QBP的相互作用，支持C1QBP作为支架促进复合物形成。ATG8s同时结合CHCHD2/CHCHD10的N端和C端，以及C1QBP。C1QBP晶体结构显示其形成三聚体，第2个LIR位于三聚体棱柱边缘，CHCHD10结合相同或邻近区域。疾病相关突变CHCHD2^T61I、CHCHD10^P34S和CHCHD10^S59L改变ATG8相互作用但不破坏复合物组装。

**CHCHD2和CHCHD10通过ATG8s降解**

过表达GFP-GABARAPL1与CHCHD2、CHCHD10或C1QBP共定位实验显示，三者均靠近GABARAPL1斑点。过表达GABARAPs减少内源性CHCHD2和CHCHD10，且该减少被bafA1抑制。ATG8结合缺陷突变体CHCHD2^R145Q和CHCHD10^ΔGL降解减慢；疾病相关突变CHCHD2^T61I、CHCHD10^S59L和CHCHD10^G58R半衰期延长。然而，ATG5或ATK7敲减不改变CHCHD2或CHCHD10降解，暗示其降解不依赖经典的ATG5-ATG7介导的ATG8脂质化途径。

CRISPR编辑的CHCHD2^T61I人类中脑样类器官（hMLOs）多巴胺能神经元中，CHCHD2^T61I与LAMP1共定位，提示慢性条件下进入溶酶体。瞬时过表达CHCHD2^T61I在bafA1处理下导致蛋白质聚集体，CHCHD10^S59L类似，提示突变体聚集体随时间或环境应激积累。

**CHCHD2和CHCHD10通过ATG8s招募ULK1复合物**

研究人员假设结合于CHCHD2/CHCHD10 C端的GABARAPs可招募其他ATG8结合蛋白。GST下拉实验显示GST-CHCHD2和GST-CHCHD10下拉ULK1（自噬起始主激酶），而GST-C1QBP不能。CHCHD10还下拉RB1CC1/FIP200（RB1诱导性卷曲螺旋1），但不下拉ATG13或ATG101。CHCHD2^Q126X、CHCHD2^R145Q、CHCHD10^Q108X和CHCHD10^Q131X等ATG8结合缺陷突变体丧失或减弱ULK1相互作用，但不影响与C1QBP的结合，证实该相互作用由ATG8s介导。Torin1处理促进HA-ULK1与CHCHD2、CHCHD10或C1QBP的信号重叠，提示上游信号调控该相互作用。然而ULK1过表达或其激酶死亡突变体ULK1^K46N均不改变CHCHD2或CHCHD10水平，ULK1激活剂BL-918或抑制剂SBI-0206965亦然，提示有其他ATG8结合蛋白参与CHCHD2和CHCHD10的降解。

**CHCHD2和CHCHD10促进自噬**

鉴于ULK1-GABARAPs相互作用促进自噬，研究人员检测了CHCHD2和CHCHD10对自噬的影响。CHCHD2敲减增强SQSTM1/p62（sequestosome 1，隔离体1），siCHCHD2减少EBSS诱导的MAP1LC3-II，提示自噬流受损。CHCHD2敲减细胞中EBSS诱导的ATG13斑点形成失败，表明自噬起始障碍。人iPSC来源的CHCHD2^T61I和CHCHD2^?/?多巴胺能神经元中，torin1诱导的WIPI2（WD重复结构域、磷脂酰肌醇相互作用2）斑点形成受损，同基因胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）自噬流测定也证实该缺陷。

CHCHD2^T61I位于N端，而CHCHD2通过C端招募ULK1。体外实验显示GST-CHCHD2-NT61I增强GABARAPL2结合，可能使复合物更紧密而间接影响CHCHD2-ULK1相互作用。同基因hESCs中，CHCHD2^T61I slightly减弱CHCHD2-ULK1相互作用，并降低磷酸化ATG14（Ser29）水平，提示ULK1活性降低，可解释观察到的自噬缺陷。

过表达CHCHD2、CHCHD10或C1QBP均减少SQSTM1，增强磷酸化BECN1/Beclin1（Ser30），提示自噬激活。CHCHD2、CHCHD10或C1QBP与mCherry-ZFYVE1/DFCP1（锌指FYVE型含蛋白1，自噬体前体标志物）共表达增加ZFYVE1斑点。利用GFP-LC3-RFP-LC3ΔG自噬报告系统，过表达CHCHD2、CHCHD10或C1QBP降低GFP:RFP比值（表明自噬激活），而CHCHD2敲减增强该比值（表明自噬-溶酶体通路阻断）。

**CHCHD2促进蛋白质聚集体清除**

CHCHD2和CHCHD10突变导致蛋白质聚集体。嘌呤霉素处理诱导细胞内泛素（ubiquitin, UB）阳性聚集体，siCHCHD2、siCHCHD10或siC1QBP显著增加UB阳性斑点。过表达CHCHD2、CHCHD10或C1QBP减少MAPT/Tau（微管相关蛋白tau）聚集体和易聚集突变体GFP-FUS^P525L（FUS RNA结合蛋白）的不溶性组分。SNCA/α-synuclein预制纤维（pre-formed fibril, PFF）转染形成的SNCA聚集体也被CHCHD2减少。利用稳定表达GFP-SNCAA53T的细胞，过表达CHCHD2、CHCHD10或C1QBP均位于SNCA聚集体旁。

体内实验中，小鼠纹状体注射PFF联合CHCHD2腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV），4周后检测显示CHCHD2减少不溶性组分中SNCA及其C末端截短形式。该C末端截短形式具有高度毒性，加速SNCA聚集体形成。SQSTM1轻微降低提示自噬激活。因此，CHCHD2帮助清除有毒SNCA物种，减少蛋白质聚集体。

**讨论与结论**

线粒体蛋白CHCHD2或CHCHD10突变导致神经退行性变伴蛋白质聚集体。本研究报道CHCHD2-CHCHD10-C1QBP与ATG8s形成复合物促进自噬和聚集体清除，揭示了CHCHD2和CHCHD10在蛋白质稳态中的未被探索作用，为神经退行性疾病的靶向治疗提供新视角。

CHCHD2-CHCHD10-C1QBP-ATG8蛋白复合物的鉴定为解析三者在自噬-溶酶体通路中的隐藏作用提供了生化基础。C1QBP作为支架通过N端α-螺旋结合CHCHD2和CHCHD10，后者C端形成同源或异源二聚体并结合另一ATG8分子，同时招募ULK1等ATG8结合蛋白。该复合物具有多价结合特性，允许精确适配并增强相互作用特异性与强度。多数疾病相关突变仍保留复合物组装能力，但慢性轻度缺陷叠加环境应激可能打破平衡，导致蛋白质聚集体和神经退行性变，这解释了此类疾病多为晚发性和年龄依赖性的特点。

研究人员还关注细胞质CHCHD2和CHCHD10的存在。虽然两者主要定位于线粒体，但部分存在于细胞质，这是其参与细胞质自噬的前提。经典方法难以捕捉细胞质池的原因在于：线粒体高度富集而细胞质丰度低；以及细胞质中快速降解。CHCHD2和CHCHD10的快速周转（t_1/2 < 2小时）对典型自噬底物而言异常之快。这种快速周转可能源于复杂的调控机制：CHCHD2作为自身转录因子的正反馈自我放大，以及作为自噬底物和激活剂的负反馈调节。有趣的是，失去或减弱C端ATG8结合的突变体半衰期延长但仍被降解，提示存在其他降解机制，如核CHCHD2可能通过MIDN（midnolin）的泛素非依赖性蛋白酶体途径降解。

本研究报道CHCHD2和CHCHD10通过GABARAPs-ULK1促进自噬起始。CHCHD2最初被鉴定为核-线粒体双定位蛋白，核内作为转录因子调节线粒体蛋白、线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response, mtUPR）及自身表达。检索腺病毒转导CHCHD2的ChIP-seq数据，发现自噬通路为第2位富集的KEGG通路，关键自噬调节因子转录本包括Map1lc3b、Gabarap、Gabarapl1、Ulk2、Atlg13等。然而瞬时CHCHD2敲减未降低自噬基因表达，而C1QBP敲减反而上调ULK1、ULK2、UVRAG、ATG3和LC3B等，提示CHCHD2的转录作用可能通过其结合复合物实现。同时，瞬时CHCHD2敲减引起多种细胞缺陷而慢性敲除表型轻微或无，除旁系同源物CHCHD10的部分补偿外，CHCHD2的转录作用及其结合伙伴可能贡献于长期基因工程中的转录适应。

CHCHD2和CHCHD10既是自噬底物又促进自噬的双重角色可能紧密关联，形成类似CCT2的复杂自我调节反馈环路。许多神经退行性疾病相关聚集体通过自噬清除，CHCHD2和CHCHD10突变导致的聚集体包括SNCA、TARDBP/TDP-43、CHCHD2和/或CHCHD10等，提示两者以广义方式关联蛋白质聚集体。GABARAPs特异性结合SNCA寡聚体而非单体，且GABARAPs功能上与蛋白质聚集体清除密切相关，其缺失比MAP1LC3s缺失导致更多聚集体形成。本研究关于CHCHD2和CHCHD10与GABARAPs结合清除聚集体的发现，支持了GABARAPs亚家族在蛋白质聚集体清除中未被充分重视的意义。

C1QBP在本研究中被发现直接结合ATG8s。鉴于其高丰度和强亲和力，C1QBP-ATG8s相互作用可能是其多效性细胞功能的缺失基础机制。心肌细胞特异性c1qbp^?/?小鼠显示自噬缺陷；复合杂合突变包括第1个LIR与人类致死性病例相关。第2个LIR位于C1QBP三聚体棱柱边缘，介导CHCHD2和CHCHD10相互作用；第1个LIR位于柔性区域，需进一步研究。此外，研究人员推测线粒体CHCHD2、CHCHD10和C1QBP可能招募ULK1和ATG8s促进PINK1-PRKN/Parkin非依赖性线粒体自噬。

本研究局限性在于：由于CHCHD2和CHCHD10的快速降解及多种ATG8亚型的功能冗余和补偿，许多结果基于相对短期过表达或体外研究。内源性蛋白标签的进一步研究将有助于解析该蛋白复合物在多种细胞机制中的精细调控。

线粒体蛋白CHCHD2或CHCHD10突变导致神经退行性变伴蛋白质聚集体。本研究表明慢性破坏的蛋白质稳态是CHCHD2或CHCHD10突变相关神经退行性变的基础。研究人员报道CHCHD2和CHCHD10既是自噬底物又是清除蛋白质聚集体的自噬受体。鉴于PD患者中CHCHD2水平降低，以及ALS或FTD患者中CHCHD10水平降低，恢复CHCHD2或CHCHD10可能通过重振自噬和线粒体功能使患者受益。