利用新设计的蛋白质实现膜蛋白的溶解与结构测定

《SCIENCE》：Membrane protein solubilization and structure determination using de novo–designed proteins

　　

编辑总结

膜嵌入蛋白因其难以生产和纯化，给体外研究带来了巨大挑战。Mihaljevi?等人提出了一种通过设计针对特定靶标的两亲性蛋白外壳来溶解跨膜蛋白的方法，该外壳能够包裹住跨膜区域。研究者证明，经过这种处理后的蛋白可以正确折叠，且适合用于结构测定、生化检测以及体外应用。——Michael A Funk

结构化摘要

引言

膜蛋白在信号传导、感染反应以及药物作用机制中起着关键作用，但由于其疏水表面会导致其在膜外结构不稳定，因此这类蛋白依然是最难生产和研究的对象之一。由于这些蛋白嵌存在于脂质膜中，因此提取它们需要使用去污剂。这一过程既繁琐又需多步操作，还需要大量优化，往往还会影响蛋白的稳定性，并增加后续分析的难度。例如，导致梅毒的革兰氏阴性菌梅毒螺旋体的外膜蛋白是很有潜力的疫苗候选分子，但它们很难在大肠杆菌中表达；而无需使用去污剂就能让这类蛋白溶解，或许有助于单克隆抗体的研发以及疫苗的设计。此前用于溶解膜蛋白且无需绕过脂质双层的策略包括突变暴露在外的脂质残基，或将膜蛋白结构域嫁接到可溶性支架上。将膜蛋白与两亲性蛋白载脂蛋白AI结合并利用可溶性诱饵，确实实现了蛋白的溶解，不过目前尚未通过这种方法确定其结构。

设计思路

为解决这一长期存在的难题，我们设计出了WRAPs——即水溶性RF扩散型两亲性蛋白，“RF扩散”指的是RoseTTAFold扩散方法。这类蛋白能够包裹住膜蛋白，遮盖其疏水区域，从而使蛋白在无去污剂的情况下仍保持溶解状态和稳定性，并能在水中与配体结合。WRAPs通过基因融合的方式与目标膜蛋白结合，直接在大肠杆菌的细胞质中表达，这样一来不仅简化了纯化流程，还降低了依赖去污剂方法的成本与复杂性。

实验结果

借助WRAPs，我们成功制备出了多种膜蛋白的可溶版本，包括单体及寡聚型的β桶状外膜蛋白，以及螺旋状多跨膜蛋白。根据目标蛋白的稳定性以及在大肠杆菌中的表达难度不同，目前有4%到80%的有序设计能在可溶组分中被检测到。我们的方法并不依赖现有的蛋白结构，因为通过该方法，我们成功溶解了AlphaFold2预测出的梅毒螺旋体外膜蛋白。经WRAP处理的膜蛋白具有热稳定性，其结构与预测结果一致，同时还能保留原有的配体结合能力和活性位点，这一点在经过工程改造的人类G蛋白偶联受体微型模型以及细菌膜内蛋白酶GlpG的研究中都得到了验证。那些分子量低于100千道尔的较小WRAP溶解蛋白虽然无法用于构建高精度模型，但通过低温电子显微镜获得的低分辨率重建图像与计算预测结果高度吻合，也符合单颗粒低温电子显微镜的分辨率限制。为了验证结构测定能力，我们选择了一个较大的细菌外膜通道寡聚体作为研究对象，最终获得了经WRAP处理的结核分枝杆菌孔蛋白的2.95埃分辨率低温电子显微镜结构，这证明了我们的方法确实能够用于测定溶液中的膜蛋白高精度结构。

结论

与以往的方法不同，经过处理的WRAP溶解蛋白无需修改其天然序列，依然能够保持结构完整性和关键功能位点。WRAPs具有广泛的应用潜力，可用于推动生化特性分析、结构测定、药物研发，以及制备保留抗原表位的可溶性蛋白以用于疫苗设计。我们预计，随着基于深度学习的蛋白设计技术不断进步，计算成本将会降低，溶解预测的准确性也会提高，进而减少需要测试的设计方案数量。

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利用全新设计的WRAPs实现膜蛋白溶解。

(1) WRAP蛋白的骨架是通过RF扩散方法设计的。(2) 目标膜蛋白（如GlpG）被安置在WRAP骨架内部。(3) 随后对WRAP骨架应用20次噪声添加与去除操作中的部分步骤，以此优化其与跨膜蛋白之间的骨架相互作用。(4) 设计WRAP蛋白序列时，目标膜蛋白的序列保持不变，仅通过ProteinMPNN算法进行设计。(5) 最终的设计方案是根据预测的AF2置信度指标进行筛选的。(6) 被选中的WRAP蛋白通过柔性连接子与膜蛋白基因融合，在大肠杆菌中表达，随后从可溶组分中提取出来。(7) 对经过处理的WRAP溶解膜蛋白的功能保持能力进行了检测，(8) 并对其进行了结构特征分析。[该图由BioRender.com生成]

摘要

由于膜整合蛋白具有大面积的疏水表面，使得其生产和结构分析变得极为复杂，这也阻碍了针对这类蛋白的疗法和疫苗的研发。在此，我们介绍了一种基于深度学习的一体化设计方法，该方法能够在保留膜蛋白的序列、折叠结构、活性位点以及配体结合能力的同时，使其实现溶解。我们设计的WRAPs——即水溶性RF扩散型两亲性蛋白，能够包裹住那些与脂质相互作用的疏水区域，从而让这些蛋白无需依赖去污剂即可具备热稳定性和水溶性。我们为单体及寡聚型的β桶状外膜蛋白，以及螺旋状多跨膜蛋白设计了相应的WRAPs。通过低温电子显微镜获得的经WRAP处理的结核分枝杆菌孔蛋白的2.95埃分辨率结构，证明了WRAPs确实可用于测定溶液中的膜蛋白结构。作为推进梅毒疫苗研发的一部分，我们还制备出了梅毒螺旋体抗原的可溶版本。