《Microorganisms》：Insight into Oily Sludge Treatment by High-Temperature Bioaugmentation: Petroleum Components Degradation and Microbial Community Regulation
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热化学清洗是含油污泥资源化回收的高效策略。然而，清洗后污泥中残留的石油组分仍对环境构成显著污染风险。本研究采用高温生物强化技术促进石油组分的去除，并探究该技术在清洗后含油污泥深度处理中的潜力，重点关注石油组分降解与微生物群落调控。结果表明，通过引入嗜热菌并联合
热化学清洗是含油污泥资源化回收的高效策略。然而，清洗后污泥中残留的石油组分仍对环境构成显著污染风险。本研究采用高温生物强化技术促进石油组分的去除，并探究该技术在清洗后含油污泥深度处理中的潜力，重点关注石油组分降解与微生物群落调控。结果表明，通过引入嗜热菌并联合200 mg/kg生物表面活性剂（T2组），石油降解性能得到大幅提升。在此条件下，石油含量与含水率分别成功降至19.6 g/kg和4%。特别地，T2组中正构烷烃（n-alkanes）和多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）含量显著降低至1098.5 mg/kg和494.3 mg/kg，相较于空白组（4428.5 mg/kg和850.7 mg/kg）降幅明显。高通量测序结果表明，外源嗜热菌（Ureibacillus和Bacillus）能够在系统中迅速成为优势属。此外，微生物关联网络与功能分析揭示，高温生物强化促使微生物相互作用由竞争转向协作，表现为正相关比例和模块度值的提升，以及功能模块从空白组的两个模块向生物强化处理组的四个模块分化，从而增强了烃类的协同降解能力。本研究为含油污泥处理提供了一种同时实现减量化和无害化的新开发途径。
研究背景与问题：石化行业在原油开采、储存和精炼过程中产生大量含油污泥，全球年产量超过6000万吨，累积存量已突破10亿吨。含油污泥作为一种大宗危险废物，其包裹的重金属、烃类、苯系物及病原微生物等对大气、水体和土壤环境存在潜在威胁。热解技术虽能有效消除石油组分并回收热解油、气等副产品，但干燥过程显著增加能耗；热化学清洗技术可回收原油，但残留原油含量（>2%）无法满足排放标准；生物降解虽被视为环境友好型处理技术，却因降解微生物活性低、受环境因素影响大等局限而难以广泛应用。因此，构建高效适配的微生物菌群并开发先进调控技术以克服上述挑战至关重要。高温条件可降低含油污泥黏度、提高有机化合物溶解度，且嗜热菌酶类抗变性能力更强、生长速率更快，但高温环境下微生物生存能力的局限性可能降低生物降解效率。目前，关于嗜热菌接种高温生物强化在含油污泥处理中的应用研究非常有限，尤其不清楚外源嗜热菌在污泥基质中的石油降解特性及微生物群落演替规律，关于嗜热菌接种联合生物表面活性剂投加强化石油降解的研究更为缺乏。
研究目的与方法：研究人员构建了以嗜热石油降解菌群接种联合生物表面活性剂投加为特征的高温生物强化系统，用于处理热化学清洗后的含油污泥。研究旨在：（1）评估所提出高温生物强化系统的石油降解性能；（2）分析过程中正构烷烃和PAHs含量的变化；（3）揭示微生物群落的演替规律。研究预期该高温生物强化技术能够实现良好的石油烃去除效率并驱动有利的微生物群落演替，从而为含油污泥的高温生物强化处理提供技术支撑。
样品来源：含油污泥样品取自中国北京某石化公司初级油分离器（38°23′24″ N, 116°29′3″ E），经热化学清洗预处理后的残余固相。用于固定石油降解菌的锯末购自北京市昌平区当地市场。
主要技术方法：研究人员采用以下关键技术开展研究：
首先，通过富集培养从含油污泥中分离获得由Bacillus velezensis AQ-1、Ureibacillus thermosphaericus AQ-3和Brevibacillus agri AQ-23组成的嗜热石油降解菌群，经16S rDNA基因PCR扩增和测序鉴定。通过血球计数板法、菌落计数法、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、红外测油仪等分析手段，评价菌株的石油降解性能、生物表面活性剂产生能力及其对石油组分的降解特性。Brevibacillus agri AQ-23产生的脂肽类生物表面活性剂经薄层色谱（TLC）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）鉴定，临界胶束浓度（CMC）为100 mg/L。
其次，设置0、50、100、200和800 mg/kg五个生物表面活性剂浓度梯度，通过7天生物降解实验优化确定200 mg/kg为最佳投加量。
然后，在生物反应器中进行三组实验：空白组（自然衰减）、T1组（嗜热微生物制剂生物强化）、T2组（嗜热微生物制剂+200 mg/kg Brevibacillus agri AQ-23产生生物表面活性剂）。将500 mL菌悬液与250 g锯末混合制备微生物制剂，与5 kg含油污泥在生物反应器中充分混合，初始含水率调至45%，油浴控制60°C，每日搅拌一次，实验周期7天。
最后，采用红外油分析仪（OIL480）测定石油含量，GC-MS（7890B-5977B）测定正构烷烃（C10-C40）和PAHs含量；采用比色法试剂盒测定脱氢酶（dehydrogenase, DHA）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）活性；采用FastDNA? Spin Kit提取总基因组DNA，NanoDrop2000检测浓度和纯度，使用338F/806R引物对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，经2%琼脂糖凝胶回收、DNA凝胶回收纯化试剂盒纯化、Qubit 4.0定量后，使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit构建文库，Illumina Miseq PE300平台测序。fastp软件进行质量控制，FLASH软件拼接，Qiime2（2024.10）中DADA2插件进行去噪获得扩增子序列变异（amplicon sequence variants, ASVs），基于Silva 16S rRNA基因数据库进行Naive Bayes分类器分类。使用mothur软件计算Alpha多样性指数，R软件绘制堆叠柱状图，vegan包生成热图分析石油组分含量和关键酶活性与优势属的相关性，PICRUSt2预测代谢和降解功能，基于Spearman相关|r|>0.6、p<0.05选择优势种（前50）进行共现网络分析，Gephi软件进行拓扑分析、模块分析和可视化。
研究结果：
一、外源嗜热菌性能评价
三株嗜热石油降解菌经鉴定为Bacillus velezensis AQ-1（短杆状，NCBI登录号PQ721805）、Ureibacillus thermosphaericus AQ-3（长杆状，PQ721806）和Brevibacillus agri AQ-23（长杆状，PQ721807）。三菌株7天内石油降解率均超45%，但对不同链长正构烷烃表现出差异化降解偏好：AQ-1对短链正构烷烃（C10-C14）降解率超60%；AQ-3对长链正构烷烃（C31-C40）降解率超55%；AQ-23则呈现广谱降解特性。等比例混合菌群石油降解率达73.2%，显微观察显示石油被乳化成小液滴且颜色逐渐变浅。Brevibacillus agri AQ-23被确认为脂肽类生物表面活性剂产生菌，液滴坍塌试验、油排环直径（5.0 cm）和乳化指数（55%）均证实其优越乳化性能，产量达3.03 g/L。鉴于系统内AQ-23限量添加难以短期产生足量生物表面活性剂，通过投加梯度实验确定200 mg/kg外源生物表面活性剂为最佳剂量，可使石油含量从61.8降至20.3 g/kg，降解率达67.2%，继续增加剂量降解率提升不显著。
二、高温生物强化对含油污泥降解的增效作用
石油含量与含水率变化：空白组石油含量从60.83仅降至54.08 g/kg；T1组显著降至35.02 g/kg；T2组进一步降至19.62 g/kg，较T1组提高25.37%，低于20 g/kg的控制标准（SY/T 7301-2016）。三组含水率均快速下降，第6天降至10%以下，T2组下降更快。减量率分别为50.01%（CK）、52.45%（T1）和56.05%（T2）。
石油组分降解：初始短链、中链和长链正构烷烃含量分别为262.5、3810.0和788.0 mg/kg。处理后中链正构烷烃去除最显著，三组分别降至3500、1615和801 mg/kg；长链正构烷烃在空白组几乎未变（719 mg/kg），T1组降至408 mg/kg，T2组进一步降至205 mg/kg。T1和T2组中链正构烷烃降解率分别为57.61%和78.98%，长链分别为48.22%和73.98%。PAHs初始含量902.7 mg/kg，空白组仅降至850.7 mg/kg；T1和T2组分别降至607.0和494.3 mg/kg，降解率32.7%和45.2%。紫外灭菌对照实验证实C10-C40和PAHs挥发率仅0.79%和0.37%，表明生物降解起主导作用。
三、高温生物强化过程中的微生物群落演替
酶活性分析：T1和T2组DHA和PPO活性均高于空白组，表明生物强化有效提高降解菌代谢活性。空白组和T1组酶活性呈先升后降趋势，与石油降解趋势一致；T2组后期酶活性持续上升，可能与生物表面活性剂维持微生物活性有关。
微生物群落结构与主要功能菌分析：ACE、Chao和Sobs指数均降低，表明高温环境导致部分细菌无法适应。门水平上，初始优势门Proteobacteria（74.8%）在空白组仍为优势（88.9%），但生物强化使Firmicutes成为T1（68.7%）和T2（89.7%）组的首要优势门，这与引入的三株菌均属Firmicutes有关。属水平上，初始以Phenylobacterium（18%）为主，高温处理后空白组优势属为Gammaproteobacteria（27.1-40.1%）、Pseudoxanthomonas（15.3-19.4%）和Tepidiphilus（11.3-21.2%）。生物强化组中，Ureibacillus迅速成为优势菌，第4天相对丰度达41.5-49.1%，第7天T2组（58.3%）显著高于T1组（27.1%，p<0.05）；Bacillus在T2组（9%）显著高于T1组（0.4%，p<0.05）；Brevibacillus则始终维持极低丰度（1-2%）。Soehngenia在生物强化组中丰度仅次于Ureibacillus。相关性分析显示Ureibacillus和Soehngenia与DHA、PPO活性显著正相关，与石油、正构烷烃、PAHs含量显著负相关；Klebsiella与PAHs含量显著负相关；Bacillus和Brevibacillus亦参与关键酶分泌。
微生物关联网络分析：空白组、T1和T2组网络平均度（AD）分别为29.89、18.72和14.92，表明高温生物强化降低了网络复杂性。但正相关比例从空白组63.39%升至T1组66.88%和T2组76.41%。模块度（MD）值从空白组0.16升至T1组0.33和T2组0.49，模块数从2个增至4个，表明生物强化促使微生物相互作用从竞争转向合作，功能趋于多元化。
优势属功能分析：PICRUSt2预测显示优势菌主要与代谢和降解功能相关，尤其能量代谢及苯乙烯、多环芳烃、萘和二甲苯降解。Paracoccus具有苯乙烯、芳香化合物、苯甲酸酯和氨基苯甲酸酯降解功能；Nocardioides与苯乙烯、类固醇、氯环己烷和氯苯降解显著相关；Mycobacterium在外源物质、苯乙烯、氯环己烷、氯苯、二噁英、柠檬烯和蒎烯降解方面潜力巨大。外源嗜热菌Ureibacillus和Brevibacillus与二甲苯降解显著相关。
讨论部分总结：研究人员指出，三株嗜热菌的功能互补性（AQ-1偏好短链烷烃、AQ-3靶向长链烷烃、AQ-23广谱降解）解释了菌群较单菌的优越性。Brevibacillus agri AQ-23产生的脂肽类生物表面活性剂CMC为100 mg/L、产量3.03 g/kg，与文献报道相比具有应用潜力，但系统内有限生物量 necessitated外源补充，200 mg/kg为最佳剂量，过量则因胶束形成物理屏障反而降低降解效率。该技术7天内实现67.2%的石油降解率，远超传统生物修复方法，且加速水分减少有利于污泥脱水。微生物群落分析证实生物强化根本性地重塑了土著微生物组，Firmicutes因成功定殖而成为优势门。Ureibacillus作为关键属，其丰度与酶活性和烃降解率强相关，T2组持续的酶活性表明生物表面活性剂有助于维持高温生物强化系统后期的强酶活性。Soehngenia的富集及Klebsiella与PAHs去除的相关性证明生物强化也刺激了土著降解菌活性。Bacillus和Brevibacillus相对丰度较低，支持功能冗余和群落平衡而非简单富集特定降解菌是有效生物修复关键的观点。网络分析表明生物强化虽降低整体网络复杂性，但加强了剩余类群间的正相关性，这种从竞争到合作的种间关系转变促进了协同降解网络的形成。模块从2个增至4个表明功能从简化向多元化转变，生物表面活性剂进一步增强了细菌间相关性。功能预测显示优势属具有降解二甲苯、苯乙烯和多环芳烃等多样烃类的互补代谢能力。综上，该技术通过生物表面活性剂乳化石油、嗜热菌分泌关键酶、土著菌富集及种间协作增强的生态协同效应，实现了含油污泥的高效处理，为含油污泥生物修复技术提供了新视角和理论基础。
研究结论：本研究凸显了采用高温生物强化处理加速含油污泥中石油组分降解的可行性。在最佳条件下，石油含量从60.83成功降至19.62 g/kg，满足石油含量控制标准（SY/T 7301-2016）。正构烷烃（C10-C40）降解率超过70%，PAHs降解率超过45%，处理后含油污泥含水率低于5%。高通量测序结果显示，外源嗜热石油降解菌快速生长并成为优势属，增强了石油降解属之间的种间合作，从而加速了石油降解。这些发现为含油污泥的快速处理提供了有价值的技术选择。
