《Toxins》：SELEX-Based Aptamer Technologies for Toxin Analysis: Screening, Optimization, and Computational Assisted Design
准确灵敏地检测毒素污染对食品安全、环境完整性和公共健康仍是一项紧迫挑战，因为传统分析方法存在成本高、现场稳定性差以及对痕量新兴污染物灵敏度不足等问题。本综述全面概述了用于毒素检测的生物传感器技术，重点关注核酸适配体（aptamer）和指数富集配体系统进化（SELEX）技术。研究人员系统分类了为毒素检测开发的九种SELEX变体，涵盖靶标固定化、文库固定化、非固定化、基于细胞和自动化平台，并强调了它们的筛选原理、适用性和局限性。本综述讨论了计算辅助适配体发现（例如基于人工智能的序列生成和分子对接）以及实验性SELEX后优化策略，如环化、多价组装和结构转换设计。然后研究人员讨论了关键挑战和未来展望，强调通过整合SELEX策略和人工智能辅助设计，从方法导向转向需求导向的适配体开发。总体而言，本综述涵盖了主流SELEX技术、适配体筛选、计算设计、实验优化和传感器集成，可作为下一代毒素检测应用的参考。
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引言
毒素污染对全球食品安全、环境完整性和人类健康构成普遍威胁，其存在于食品、饮用水、土壤和空气基质中。值得注意的是，这些毒素很大一部分被归类为新兴污染物（ECs）——天然有毒物，由于环境归趋不明、监测方案不足以及即使在痕量水平也具有强毒理学效应（包括真菌毒素、淡水/海洋藻毒素如微囊藻毒素、新型农药毒素和抗生素耐药菌株的细菌外毒素）而受到广泛关注。与常规污染物不同，这些与EC相关的毒素往往逃避常规环境和食品安全监测，但其痕量积累可引发严重毒理学效应（如致癌性、神经毒性和肝毒性），从而在全球范围内造成巨大的公共健康风险和沉重的经济负担。因此，准确、灵敏和快速地检测毒素——特别是ECs——对于早期危害识别、及时风险缓解以及有效保护人类健康和生态安全至关重要。
毒素检测方法大致分为分析型和非分析型方法。成熟的分析方法以高效液相色谱（HPLC）和液相色谱（LC）技术为主；虽然HPLC-UVD/FLD和LC-MS能够对大多数毒素组进行明确的定性和定量分析，但其广泛应用受到对认证参考标准的过度依赖、高昂仪器成本、劳动密集型且耗时的样品前处理以及需要专业操作知识的严重限制。这些局限性将此类技术局限于实验室分析而非现场即时检测（POST）。非分析方法包括小鼠生物测定、细胞测定、免疫测定、酶抑制测定、受体结合测定和生物传感器。其中，酶联免疫吸附测定（ELISA）和侧流层析试纸条减轻了对认证参考标准的依赖，但表现出关键的固有局限性：它们不能区分毒素类似物，并且对痕量小分子毒素的灵敏度不足。此外，抗体在现场稳定性差，且难以针对表位有限的小分子毒素生成，而酶在非实验室条件下容易变性和失活——这两个问题严重损害了检测结果的重现性和可靠性。总的来说，这些缺点构成了毒素检测的关键技术瓶颈，产生了对集成高灵敏度、优异稳定性、低成本、现场可操作性和宽检测范围的新型检测平台的迫切需求。
在此背景下，生物传感器技术已成为传统分析和非分析检测方法的有前途替代方案，并成为食品安全和环境监测领域中EC相关毒素检测的研究热点。生物传感器是一种生物分析装置，它集成了生物识别元件和换能器，将特定的生物识别响应转化为可测量的电信号。对于毒素检测，生物传感器按生物识别元件分为几种类型：酶基、免疫传感器（抗体基）、受体基、组织/细胞/细胞器基和核酸基生物传感器。酶和免疫传感器是最成熟的传统生物传感器类型，而受体和组织/细胞器基生物传感器在海洋毒素检测领域进展迅速。然而，这些传统生物传感器受到其生物识别元件固有缺陷的严重限制：苛刻现场条件下的酶变性、抗体稳定性差以及针对小分子毒素制备困难、受体传感器天然靶标不稳定，以及组织/细胞器传感器对细胞/组织培养的高度专业要求。总的来说，这些局限性反映了传统分析和非分析方法的缺点——高成本、现场稳定性差和灵敏度不足——凸显了对能够克服这些障碍的新型生物识别元件的需求。
与这些生物识别元件相比，核酸适配体结合了化学稳定性、合成可及性和广泛的靶标范围。为了克服这些关键限制，核酸适配体近年来作为新型高性能生物识别元件受到了广泛关注，而SELEX（指数富集配体系统进化）技术——核心体外适配体筛选方法——已成为开发高性能毒素检测生物传感器的关键使能技术。作为具有高亲和力和对靶标分析物特异性的合成单链DNA/RNA（ssDNA/RNA）分子，适配体在毒素检测应用中优于传统酶、抗体和天然受体：它们允许可重复的化学合成和修饰，在极端条件（如高温、极端pH）下保持优异的结构和功能稳定性，并能识别广泛的EC相关毒素，包括小分子真菌毒素和大分子细菌外毒素。SELEX技术及其衍生平台的迭代优化显著提高了针对不同毒素的高亲和力适配体的筛选效率。同时，计算模拟工具、人工智能辅助设计和实验验证的集成推进了多尺度适配体优化框架的发展，从而为制造超灵敏和抗干扰的适配体生物传感器（适配体传感器）奠定了坚实基础。
尽管取得了这些进展，仍存在几个关键空白。首先，尽管已经开发了各种SELEX变体用于毒素检测，但对这些平台的系统分类——强调其筛选原理、在不同毒素类型上的适用性以及固有局限性——仍然缺乏。其次，将计算模拟、人工智能辅助设计和实验验证集成到统一的适配体优化框架中，尚未针对毒素检测应用进行全面综述。
基于这一研究空白，本综述全面总结了用于毒素检测的生物传感器技术的最新进展，重点关注核酸适配体和SELEX技术优化。研究人员首先系统分类了为毒素检测开发的九种SELEX变体，强调其筛选原理、在不同毒素类型上的适用性以及固有的优点和局限性。接下来，详细阐述了集成计算模拟工具和实验验证方法（截短、化学修饰、多价适配体组装）的多尺度适配体优化框架。最后，讨论了关键挑战和未来展望，强调通过整合SELEX策略和人工智能辅助设计，从方法导向转向需求导向的适配体开发。
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基本SELEX原理
适配体是短的合成核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）分子，最早由Ellington、Tuerk和Robertson等在20世纪90年代初独立报道。SELEX是一种体外筛选技术，通过迭代的孵育、分离和扩增步骤，从大的随机序列文库中分离高亲和力核酸适配体。值得注意的是，几乎所有通过SELEX生成的适配体都对其靶标表现出强结合亲和力，解离常数（Kd）通常在纳摩尔到皮摩尔范围。经典SELEX工作流程包括：（1）将ssDNA/RNA文库与靶标毒素孵育；（2）将毒素-适配体复合物与未结合序列分离（例如通过离心、过滤或毛细管电泳）；（3）使用PCR（对于DNA）或RT-PCR（对于RNA）扩增结合的序列；（4）重复这些步骤（3-10轮）以富集高亲和力适配体，随后进行测序和表征。经典SELEX实验通常采用初始随机寡核苷酸文库，包含1013至1015个独特序列，每个寡核苷酸由一个20-80个核苷酸（最广泛采用的长度为30-50个核苷酸）的可变随机核心组成，两侧为5'和3'端18-21个核苷酸的保守引物结合区。为了提高对密切相关毒素类似物的特异性，可以将反选择步骤（例如与结构相似的非靶分子预孵育）纳入筛选方案，通常在初始富集轮次之后。此外，为了克服经典SELEX的局限性，出现了用于多种应用的衍生SELEX方法，在毒素检测中具有固有优势：解决小分子毒素表位有限的问题，解决疏水聚集问题，并实现在真实基质中对痕量靶标（pg/mL-fM）的超灵敏结合，从而显著提高筛选效率。
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用于毒素特异性适配体筛选的SELEX技术
鉴于毒素分子结构的多样性——从小分子真菌毒素（200-900 Da）到大分子蛋白质毒素（30-150 kDa）——研究人员开发了各种专门的SELEX变体，以适应不同的靶标特性。SELEX技术可根据分离原理和筛选策略系统地分为五类：靶标固定化SELEX、文库固定化SELEX、非固定化SELEX、基于细胞的SELEX以及高通量和自动化SELEX平台。
3.1. 靶标固定化SELEX
3.1.1. 磁珠SELEX（MB-SELEX）
磁珠最初用于适配体筛选是在1996年，Hamm将其用于分离抗铁蛋白抗体H107的结合适配体。1997年，Bruno进一步推进了这种方法，使用甲苯磺酰基活化和未包被的磁珠（直径4.5 μm）以及长链烷基胺磁性多孔玻璃来筛选针对小分子靶标的DNA配体。与依赖膜过滤、柱色谱或微孔板洗涤的传统SELEX方法相比，这些方法分离效率低且通常需要10-20轮筛选，引入顺磁珠作为固体支持物可实现快速磁分离，消除了劳动密集型的离心或过滤步骤。该方法具有几个关键优点：低样品消耗（50-250 μL）、严格的洗涤且结合序列损失最小，以及可直接从珠表面进行PCR扩增而无需额外的洗脱步骤。此外，磁珠具有广泛的商业尺寸范围（0.04-70 μm）和多样化的表面官能团（胺、羧酸、甲苯磺酰基、环氧基、链霉亲和素、Ni-NTA），提供了针对不同靶分子的灵活偶联策略。
对于毒素检测，MB-SELEX已广泛应用于小分子毒素和大蛋白质毒素。小分子例子包括使用胺功能化珠的黄曲霉毒素B2（AFB2）（10轮），以及通过与载体蛋白缀合并经由环氧基团固定的石房蛤毒素（STX）。对于大蛋白质毒素，MB-SELEX已产生针对葡萄球菌肠毒素的适配体（14轮）。所选适配体的解离常数通常在纳摩尔范围。然而，MB-SELEX具有固有局限性。随机靶标固定化可能掩盖关键表位，产生识别固定化靶标而非其天然构象的适配体。珠表面上高的靶标密度可诱导多价效应，导致亲和力高估（表观Kd低于真实值），并可能选择出在均相溶液中无法结合靶标的适配体。为了解决这些局限性，已经开发了先进的MB相关技术，包括Capture-SELEX、FluMag-SELEX和微流控SELEX。
3.1.2. 荧光磁珠SELEX（FluMag-SELEX）
SELEX技术的一项开创性进展由Bruno于1997年报道，他引入了磁微粒用于靶标固定化和荧光检测相结合的方法，以监测针对氯芳香族化合物4-氯苯胺、2,4,6-三氯苯胺和五氯苯酚的核酸结合。FluMag-SELEX由Stoltenburg等人于2005年正式引入，作为MB-SELEX的进步，它结合了荧光标记以定量监测筛选过程。该技术将靶标固定在磁珠上，并通过PCR扩增期间标记的引物对寡核苷酸文库进行荧光标记，从而能够定量监测整个筛选过程中适配体的富集。主要优点包括快速磁分离、精确跟踪筛选进程，以及能够计算富集因子以优化筛选严格性，同时避免使用放射性标记。
FluMag-SELEX已成功应用于针对几种毒素相关靶标的适配体筛选，包括多氯联苯（PCBs），一类环境毒素，解离常数在微摩尔范围，检测限低至0.1 ng/mL。此外，亥姆霍兹环境研究中心（UFZ）报道了FluMag-SELEX用于选择针对毒素、细菌脂多糖（LPS）和金黄色葡萄球菌蛋白A的适配体。然而，与其他SELEX形式（如GO-SELEX和Capture-SELEX）相比，FluMag-SELEX在小分子毒素适配体筛选中的应用仍然相对有限，大多数报道的研究集中在蛋白质或大分子量靶标上。这部分是因为靶标固定化——FluMag-SELEX的先决条件——可能改变小分子毒素的表面化学性质，可能损害识别天然分析物的适配体的选择。尽管如此，FluMag-SELEX仍然是针对蛋白质毒素和大分子靶标的有价值的平台，在这些情况下固定化不会干扰天然构象。
3.2. 文库固定化SELEX
在文库固定化SELEX中，寡核苷酸文库锚定在固体支持物上，靶标结合诱导构象变化，释放结合的序列。
3.2.1. Capture SELEX
Capture-SELEX作为文库固定化SELEX，部分源自FluMag-SELEX，其特征在于靶标固定在磁珠上和寡核苷酸的荧光标记用于定量。关键区别在于靶标和寡核苷酸的呈现方式：Capture-SELEX旨在选择不适合固定在固体表面的靶标（如小有机分子）的适配体，通过实现寡核苷酸文库的固定化而不是靶标固定化。该设计改编自结构转换适配体概念，其中文库通过互补对接序列锚定在固体支持物上，靶标结合诱导构象变化，释放结合的序列。在Capture-SELEX中，文库通过生物素化的捕获探针固定在链霉亲和素包被的磁珠上，靶标诱导的结构转换将高亲和力适配体释放到溶液中，而未结合的序列通过磁分离去除。这种文库固定化策略保留了小分子靶标的天然构象，通常产生短链适配体（约40个核苷酸），具有明确的二级结构，便于SELEX后截短和优化。值得注意的是，增加捕获探针的长度可以增强筛选严格性并促进更高亲和力适配体的富集。
Capture-SELEX已被证明特别有效地生成针对由于官能团有限或疏水性而难以固定的小分子毒素的适配体。针对河豚毒素（TTX）的高亲和力适配体经过23轮筛选获得，通过基于珠的比色法测定Kd= 25 nM。针对真菌毒素玉米赤霉烯酮（ZEN）的适配体经过8轮Capture-SELEX获得，Kd= 15.2 ± 3.4 nM。此外，针对海洋生物毒素裸甲藻素-A（GYM-A）的DNA适配体被筛选出来，截短后适配体G48nop达到Kd= 95.30 nM。最近的研究已将Capture-SELEX的应用扩展到更广泛的毒素。2025年，Ebanks等人报道使用Capture-SELEX筛选针对AFB1的DNA适配体，达到Kd= 42.1 ± 23.8 nM，并随后开发了用于花生提取物中检测的侧向层析 assay。Sun等人成功分离出针对azaspiracid-2（AZA-2）的高亲和力适配体，优化后Kd值低至68 nM。此外，Lock展示了使用改进的Capture-SELEX方案结合高通量测序快速筛选针对T-2和HT-2真菌毒素的适配体，显著缩短了筛选时间。
尽管有其优点，Capture-SELEX存在固有局限性，包括结合序列的释放效率低、对捕获基质的非特异性结合、由于动态解离平衡导致的假阳性以及文库多样性降低。为了减轻这些缺点，已成功采用增加捕获探针长度以增强筛选严格性、纳入反选择步骤以及与高通量测序结合以实时监测富集动态等策略。此外，与微流控平台的集成使得能够更精确地控制筛选条件，减少非特异性滞留并提高整体效率。
3.2.2. GO-SELEX（氧化石墨烯SELEX）
GO-SELEX由Park等人于2012年首次引入，用于针对烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的适配体筛选。该技术采用氧化石墨烯（GO）作为吸附介质。GO是一种富含含氧官能团（环氧基、羧基、羟基）的二维碳纳米材料，通过核酸碱基与六方碳单元之间的π-π堆积相互作用吸附游离ssDNA，而双链DNA由于其碱基埋藏而不被吸附。在筛选过程中，GO吸附未结合的ssDNA，但不吸附经历构象变化的靶标结合序列，从而可通过离心轻松分离。为了增加筛选压力，开发了三种操作模式：基本模式（靶标在GO添加之前与文库孵育）、对抗模式（首先添加GO以固定文库，然后靶标竞争结合）和竞争模式（掺入靶标类似物以消除交叉反应序列）。在这种文库固定化形式中，GO充当吸附ssDNA文库的固体支持物，靶标结合将适配体从GO表面释放。这种方法保留了靶标的天然构象，操作简单快速，并避免了对靶标修饰的需要。
GO-SELEX已成功应用于筛选针对广泛小分子毒素的DNA适配体，包括真菌毒素、海洋毒素和大豆毒素。对于真菌毒素，已获得针对T-2毒素（Kd= 20.8 ± 3.1 nM）和AFM1（Kd= 109.10 ± 6.02 nM）的高亲和力适配体。对于海洋毒素，已筛选出针对冈田酸（OA）（Kd= 40 nM）、STX（Kd= 50.75 ± 14.97 nM）和膝沟藻毒素1/4（GTX1/4）（Kd= 17.7 nM）的适配体。除了针对单一分析物的传统GO-SELEX外，还开发了多种SELEX策略用于同时筛选多个靶标。Nguyen等人首次建立了多重GO-SELEX，以筛选针对三种农药的适配体，产生了十种不同的适配体（Kd= 10-100 nM），包括能够同时结合两个或三个靶标的交叉反应序列。随后，Gu等人开发了磁性还原氧化石墨烯（MRGO）-SELEX，用于针对三种海洋毒素的多重筛选，获得了每种毒素的特异性适配体以及能够结合软骨藻酸（DA）或TTX的多靶标适配体。
然而，在GO-SELEX的分离步骤中可能发生弱结合序列的自发解吸，可能导致富集池污染以及未结合ssDNA的不完全去除。此外，残留的GO颗粒可能干扰下游应用，如PCR扩增或传感器制造，需要仔细的纯化步骤。吸附效率也可能受靶分子物理化学性质的影响，某些靶标可能无法诱导足够的构象变化以从GO表面有效解吸。尽管存在这些局限性，GO-SELEX仍然是生成针对小分子毒素和其他固定化具有挑战性的靶标的高亲和力适配体的强大通用平台。
3.2.3. GNP-SELEX（金纳米粒子辅助SELEX）
与GO-SELEX类似，GNP-SELEX作为文库固定化平台运行。它依赖于ssDNA文库通过静电和范德华相互作用优先吸附在金纳米粒子（GNPs）上。在典型的GNP-SELEX工作流程中，首先将ssDNA文库固定在GNP表面。在没有靶标的情况下，吸附的ssDNA稳定GNPs免受盐诱导的聚集。添加靶标后，靶标与固定的ssDNA之间的特异性结合诱导构象变化，触发适配体从GNP表面解吸（释放）。释放的GNPs随后在盐（如NaCl）存在下易于聚集，产生从红色到紫色的可见颜色变化。这种靶标诱导的释放机制使得无需复杂仪器即可实时视觉监测适配体富集，同时保持靶标无固定化，从而保留其天然构象。
GNP-SELEX的发展是为了解决残留结合现象——即即使靶标结合后适配体仍吸附在GNPs上，损害灵敏度。Chatterjee等人独立开发了GOLD SELEX，其中文库首先与GNPs孵育，只有当序列的结合亲和力大于其对GNPs的亲和力时，才会在靶标添加后释放，从而提高适配体灵敏度。在此基础上，Lee等人随后建立了GNP-SELEX作为一种用于小分子适配体发现的视觉、自我监测平台。通过交替的正负筛选轮次，由消光比（E520/E700）监测，该方法能够快速确定靶标特异性适配体富集，无需靶标修饰或SELEX后分析如qPCR。
作为一个最近开发的平台，GNP-SELEX迄今为止应用于有限但不断增长的小分子靶标范围。对于油菜素内酯（BL）和双酚A（BPA），Lee等人分别在9轮和11轮后鉴定出适配体gBL9-20（Kd= 32.9 nM）和gBPA11-40（Kd= 58.7 nM）。通过3D分子模拟和截短，他们获得了增强的适配体tgBL-v2（Kd= 17.3 nM）和tgBPA-v2（Kd= 37.9 nM），分别用于开发植物提取物中BL检测的适配体介导沉淀测定（检测限（LOD）= 0.6 pg/mL）和热敏纸收据上BPA检测的比色DNAzyme测定（LOD = 0.3 ng/mL）。
尽管有其优点，GNP-SELEX存在固有局限性。Ding等人报道，在针对腺苷的适配体筛选过程中，从GNPs释放的DNA量极低，大部分ssDNA保持吸附。这种强吸附可能阻止某些小分子靶标与ssDNA结合，或者将结合的适配体保留在GNP表面，限制了GNP-SELEX对弱结合亲和力靶标的适用性。此外，该技术可能不适用于本身对GNPs具有内在亲和力的靶标，因为这会干扰筛选过程。还观察到在靶标存在下过量的非靶序列非特异性吸附和低DNA释放效率（<1%），并且由于直接的蛋白质-GNP相互作用，该技术可能不适用于某些蛋白质靶标。
3.3. 非固定化SELEX
毛细管电泳SELEX（CE-SELEX）由Mendonsa和Bowser于2004年开创，他们仅在四轮内成功筛选出针对人IgE的适配体。该技术利用毛细管电泳，根据自由溶液中电泳迁移率的差异分离结合和未结合的序列。靶分子和寡核苷酸文库以其天然构象相互作用，靶标-适配体复合物比较游离ssDNA迁移更快，从而在每轮几分钟内实现高效分离。该方法具有高分辨率、快速分离和卓越的筛选效率，通常将筛选轮次减少到1-4轮，而传统方法需要10-20轮。几个关键优点使CE-SELEX区别于固定化SELEX方法。它在完全自由溶液中操作，消除了靶标或文库固定化的需要，避免了结构掩蔽。当与荧光标记文库耦合时，它能够实时视觉监测复合物形成和富集动态。该技术还消除了对负选择步骤的需要，其纳升进样体积最小化了文库和靶标的消耗，使其特别适用于珍贵或有限的样品。
CE-SELEX已广泛应用于蛋白质靶标，包括神经肽Y（NPY）、组蛋白H4-K16Ac、糖基化VEGF肽片段、CRISPR/Cas9等，证明了其对多种生物分子靶标的多功能性。尽管CE-SELEX在毒素检测中的应用仍然有限，Tang等人成功应用CE-SELEX筛选针对蓖麻毒素的适配体。仅经过四轮筛选，富集池对蓖麻毒素表现出87.2%的结合，并获得了Kd为58 nM和80 nM的高亲和力适配体。
尽管有其优点，CE-SELEX在小分子毒素适配体筛选中的应用仍然有限，这是由于技术挑战。直接可视化靶标-适配体复合物很困难，使得准确收集具有挑战性。分离效率对溶液性质（离子强度、pH）高度敏感，这可能与最佳结合条件冲突。纳升进样体积限制了文库多样性，可能导致结合序列的不完全回收。此外，复合物和游离ssDNA之间的电泳迁移率差异小可能阻碍有效分离。CE-SELEX还需要专门的仪器和技术专业知识。为了应对这些挑战，开发了低pH CE-SELEX（LpH-CE-SELEX）变体。通过将分离缓冲液pH降至2.6，蛋白质带正电荷而ssDNA保持带负电荷，从而实现反向迁移并便于收集蛋白质-ssDNA复合物。
3.4. 细胞SELEX/全细胞SELEX（WC-SELEX）
与需要纯化靶分子的传统SELEX方法不同，细胞SELEX（也称为全细胞SELEX）利用全活细胞作为筛选靶标，将膜蛋白和表面标志物以其天然状态保留，具有天然翻译后修饰。SELEX应用于细胞靶标最早由Morris等人（1998）使用红细胞膜证明。随后，Daniels等人（2003）将该方法扩展到全活癌细胞，建立了现在广泛称为全细胞SELEX的方法学。该技术后来由Shangguan等人在Weihong Tan的领导下进一步完善和推广，他们使用全细胞SELEX成功筛选出针对各种癌细胞的适配体。典型的细胞SELEX工作流程涉及交替的负选择和正选择轮次。在负选择步骤中，将ssDNA文库与反靶细胞孵育以去除非特异性结合子；然后将未结合的序列在正选择步骤中与靶细胞孵育，允许特异性适配体结合其同源表面表位。洗涤后，结合的适配体通过热变性洗脱，通过PCR扩增并转化为ssDNA用于后续轮次。通常需要10-20轮筛选以实现高亲和力和特异性。与靶纯化SELEX相比，该方法有几个关键优点：它维持细胞表面靶标的天然构象，能够同时发现针对多个未知表面标志物的适配体，并避免靶标纯化的需要——对于膜蛋白和其他难以表达的靶标特别有价值。
细胞SELEX最初是由癌症研究中分子探针的需求驱动的，能够选择识别肿瘤细胞表面标志物的适配体，而无需事先了解其分子身份——这一能力后来扩展到检测产毒细菌和寄生病原体。对于细菌病原体，将SELEX应用于全细菌细胞的早期例子由Bruno和Kiel于1999年证明，他们使用高压灭菌的孢子作为靶标成功筛选出针对炭疽芽孢杆菌孢子的DNA适配体。Song等人（2019）采用细胞SELEX结合功能化氧化石墨烯和滚环扩增，获得了针对副溶血性弧菌的高特异性适配体（Kd= 10.30 ± 2.50 nM）。对于寄生病原体，Nagarkatti等人（2012）使用全细胞SELEX针对克氏锥虫的活锥鞭毛体开发了RNA适配体（Kd= 7.68 ± 1.63 nM）。
尽管对病原体检测有用，细胞SELEX不太适合直接筛选游离毒素，因为大多数毒素是分泌的可溶性分子，不锚定在细胞表面。其他局限性包括高文库复杂性、细胞间变异性、选择针对非毒素表面蛋白的适配体的风险，以及维持活细胞的劳动密集型要求。为了应对这些挑战，已经开发了改进的平台，如FACS辅助、3D培养基、纳米材料辅助和微流控芯片基细胞SELEX，并且向组织SELEX的演变提供了更具生理相关性的方法。然而，对于直接游离毒素检测，非固定化SELEX和文库固定化方法通常更合适。
3.5. 高通量和自动化SELEX平台
与上述根据靶标-文库相互作用模式定义的类别不同，本节描述的方法是技术增强，可以与基于固定化或非固定化的SELEX结合以提高效率和通量。
3.5.1. 微流控SELEX
微流控SELEX将整个适配体筛选过程集成到微加工芯片中，实现自动化、高通量筛选，试剂消耗最少，并精确控制流体动力学、孵育时间和分离效率。该概念由Hybarger等人于2006年开创，他们开发了第一个基于微流控的自动化SELEX原型。从那时起，微流控平台通过自动化劳动密集型步骤（如混合、孵育、洗涤和扩增）彻底改变了适配体筛选，显著减少了人工干预和实验变异性。几个关键优点使微流控SELEX区别于传统方法。首先，微型化系统大幅减少了样品和试剂消耗（从毫升到微升），降低了成本，并实现了珍贵靶标的筛选。第二，精确控制流速、孵育时间和洗涤过程中的剪切力增强了筛选严格性和重现性。第三，将多种功能（包括混合、孵育、分离和扩增）集成到单个芯片上实现了自动化和并行处理，消除了人为错误和交叉污染风险。第四，能够在芯片上纳入负选择和反选择步骤提高了适配体特异性。因此，微流控SELEX通常仅需5-8轮（而传统SELEX需要10-20轮），并且可以在数小时或数天内完成，而不是数月。
微流控SELEX已成功应用于筛选针对各类毒素的适配体，包括蓝藻毒素、真菌毒素、海洋毒素、环境污染物和农药残留。对于蓝藻毒素微囊藻毒素-LR（MC-LR），一种对人类健康有害的强效肝毒素，使用荧光标记适配体的微流控适配体传感器系统实现了LOD = 1.9 ppb，显著低于世界卫生组织娱乐用水的安全阈值。对于真菌毒素赭曲霉毒素A（OTA），一种芯片实验室适配体传感器实现了LOD为1.3 ng/mL，检测范围为5-200 ng/mL，而基于石墨烯场效应晶体管的微流控适配体传感器达到了超低LOD为4 pg/mL（10 pg/mL至4 ng/mL）。对于牛奶中发现的一类I类致癌物AFM1，微流控纸基分析装置（μPAD）在缓冲液中实现了3 pM的LOD，在牛奶中实现了10 nM的LOD。对于OA，电化学微流控生物芯片实现了8 pM的LOD，线性检测范围为10-250 nM。对于PCBs，一种环境毒素，微流控电化学适配体传感器实现了超低LOD为0.16 fg/mL，宽检测范围为0.1 pg/mL至1000 ng/mL。对于TTX，基于微流控的平台实现了纳摩尔范围的检测限。对于农药残留，使用金涂层聚苯乙烯微粒的智能手机集成微流控适配体传感器实现了对新烟碱和甲基硫菌灵的快速、无标记检测，检测限分别为3.12 ppm和1.56 ppm。
尽管如此，尽管取得了这些进展，微流控SELEX的几个局限性仍然存在，包括需要专业知识的复杂芯片制造、微通道内的珠聚集以及在临床应用中扩展规模的挑战。为了应对这些挑战，几个新兴方向有望进一步增强该平台。条件SELEX使得能够在变化的离子浓度、pH和温度下进行适配体筛选，以在生理环境中保持功能。体内样SELEX模拟复杂的生物条件，如肿瘤微环境或患者血液，选择在生物液体中保持高亲和力的适配体。此外，微流控芯片上的非SELEX方法通过仅依赖高分辨率分区技术消除了PCR扩增偏差。随着芯片设计、自动化和生物信息学工具（如AlphaFold）的持续进步，微流控SELEX有望在毒素检测和其他应用的快速适配体发现中发挥越来越重要的作用。
3.5.2. 高通量SELEX（HT-SELEX）
HT-SELEX由Zhao等人于2009年首次引入，他们创造了这个术语，并证明单轮筛选结合高通量测序可以准确推断结合能，优于标准基序发现算法。这将HT-SELEX确立为解析分子识别能量基础的定量平台，而不仅仅是筛选高亲和力序列的工具。该方法随后由Jolma等人（2010）推广，他们将大规模平行测序应用于同时表征多个转录因子的DNA结合特异性。与传统SELEX相比，HT-SELEX有几个关键优点。传统SELEX需要2-3个月进行9-20轮，而HT-SELEX能够在每轮后进行深度测序以跟踪序列富集动态，从而将筛选轮次显著减少（通常<8轮），总时间在三周内。通过跨筛选轮生成全面的序列富集谱，HT-SELEX使得能够映射结合亲和力景观跨越序列空间，识别对靶标识别至关重要的保守基序，以及系统评估序列变异对结合功能的影响。
对于毒素检测，HT-SELEX的应用近年来有所增长。Shareef和Hariprasad（2025）将HT-SELEX与AuNP-SELEX结合筛选针对AFB1的适配体，鉴定出适配体L2，Kd= 1.24 nM，荧光测定实现了0.53 nM的LOD。对于细菌毒素检测，Oliveira等人（2024）将HT-SELEX应用于葡萄球菌肠毒素A（SEA），分析了10轮筛选后约300万个适配体候选物，鉴定出Kd= 13.36 ± 18.62 nM的适配体。
尽管有其优点，HT-SELEX需要高通量测序基础设施、大量计算资源和NGS数据处理方面的专业知识。此外，NGS的高成本可能限制其在常规实验室使用的可及性，并且强大的生物信息学流程对于区分真实的富集与PCR偏差和扩增伪影至关重要。正如Takahashi等人（2016）所证明的，仔细优化扩增条件仍然至关重要，因为不同的PCR方法（例如常规溶液PCR与微滴数字PCR）可能导致不同的筛选结果。此外，SNP-SELEX等扩展突出了解释序列变异的复杂性，强调了需要先进的计算模型来准确评估结合效应。除了适配体发现，HT-SELEX已演变为机制探索的平台。Mukherjee等人（2021）将HT-SELEX与生物信息学基序分析（RaptRanker）结合，以识别pre-miRNA负责与小分子配体结合的序列-结构基序，为RNA-小分子相互作用和miRNA生物发生提供了机制见解。最近，人工智能与HT-SELEX的集成使得能够从头设计功能性核酸，如InstructNA框架所例证的，它产生了比传统HT-SELEX显著更强的结合剂。
上述九种SELEX变体的关键特征、优点和局限性总结在表1中。
不同的修饰SELEX变体并非简单地优于或替代彼此；相反，它们构成了一个组合工具箱，根据靶标分子量、筛选目标和实验资源进行选择。对于大分子蛋白质毒素，MB-SELEX和CE-SELEX由于其高效的分离能力和对天然靶标构象的良好保存而表现出色。对于小分子毒素，文库固定化策略包括Capture-SELEX、GO-SELEX和GNP-SELEX是首选，因为它们避免了靶标固定化引起的表位掩蔽。在筛选效率方面，微流控SELEX和CE-SELEX可以将传统的多个月筛选过程缩短到几天甚至几小时，但它们分别受到复杂芯片制造和纳升进样体积限制文库覆盖的限制。尽管HT-SELEX能够通过深度测序在全序列空间进行亲和力分析，但它受到PCR扩增偏差和大量测序成本的困扰。近年来，研究人员已超越单个SELEX平台的优化，转向集成跨策略。代表性组合包括将HT-SELEX的高通量序列输出与GNP-SELEX的快速视觉验证耦合，或者在微流控芯片上进行初步富集后直接进行分子对接模拟。
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挑战与展望
4.1. 毒素检测的关键挑战
尽管过去三十年中SELEX技术取得了显著进展，如表2所示，但在其应用于毒素检测方面仍存在几个关键挑战，特别是对于痕量存在和复杂环境归趋的ECs。这些挑战跨越了小分子识别的基本限制、复杂样品基质中的实际障碍、RNA适配体筛选特有的技术困难以及与高通量筛选平台相关的权衡。
小分子毒素适配体筛选的挑战。尽管SELEX已成功应用于广泛的小分子毒素，但小分子的内在特性——有限的表位和较少的相互作用位点——通常使得与蛋白质靶标相比，实现超高亲和力更具挑战性。它们与核酸适配体的相互作用主要依赖于弱作用力，如氢键、疏水相互作用和π-π堆积，而不是蛋白质-适配体复合物典型的广泛接触界面。无固定化SELEX方法在很大程度上克服了与靶标固定化相关的构象问题，但实现小分子皮摩尔水平的亲和力仍然要求很高。
复杂基质中的抗干扰能力。真实样品（例如食品提取物、环境水、血清）含有丰富的干扰物质（脂质、蛋白质、多糖），这些物质可能非特异性地结合非靶序列或与靶标竞争适配体结合位点。尽管负选择和反选择可以提高特异性，但在复杂基质中保持高亲和力和选择性仍然是一个主要挑战，基质效应通常使复杂样品（如牛奶、啤酒、咖啡和葡萄酒）中的检测灵敏度降低一个数量级以上。
RNA适配体筛选特有的技术挑战。RNA适配体提供独特的结构多样性，并可被设计为核糖酶和适配酶等功能性核酸，实现无标记信号放大，并为研究RNA-小分子相互作用提供有价值的工具。然而，它们在毒素检测中的应用仍然有限，因为技术挑战：RNA极易受核酸酶降解，筛选过程涉及逆转录和体外转录，比DNA SELEX更耗时且昂贵，并且文库合成偏差可能影响筛选结果。尽管如此，最近的研究已经证明了RNA适配体的潜力，包括识别pre-miRNA结合小分子的基序和使用液滴微流控开发荧光RNA生物传感器。
筛选效率和成本。传统SELEX需要2-3个月进行10-20轮，消耗大量试剂和人力。传统SELEX未能识别出最佳适配体序列：（1）初始文库分子多样性不足，无法覆盖所有潜在的高亲和力序列；（2）复杂折叠的高亲和力寡核苷酸PCR扩增不良，并在重复筛选周期中丢失；（3）SELEX仅富集局部功能序列而非全局最优序列，这一点通过SELEX后截短/突变测试得到证实。随着对快速、高通量和成本效益的适配体发现的需求增长，特别是对于复杂环境和食品样品中的毒素检测，传统SELEX的局限性变得越来越明显。为了应对这些挑战，HT-SELEX和微流控SELEX已成为强大的替代方案，通过将筛选轮次减少到通常<8轮，时间缩短到数天或数小时，显著提高了效率。然而，这些先进平台也带来了新的挑战。高通量测序所需的仪器仍然昂贵，相关的计算资源和生物信息学专业知识增加了总体成本，限制了常规实验室的可及性。此外，处理数百万个序列以区分真实的富集与PCR偏差需要复杂的算法和仔细的实验设计。不同的PCR方法（例如常规溶液PCR与微滴数字PCR）可能导致不同的筛选结果，进一步使数据解释复杂化，并强调了标准化方案的必要性。
4.2. 未来方向
为了克服单个SELEX平台的固有局限性，研究人员越来越多地开发集成和多维策略。这些包括新型纳米材料（GO、GNPs、磁珠）、多靶标筛选和微流控自动化。除了这些材料和方法创新之外，人工智能与HT-SELEX的融合正在将适配体发现从筛选驱动的过程重塑为设计驱动的学科。以下各节讨论这些新兴范式。
4.2.1. 材料与方法创新
材料创新。新型纳米材料的引入通过提供新的分离机制和信号转导模式彻底改变了SELEX。GO作为高效吸附介质用于无固定化筛选，使得能够筛选针对T-2毒素、OA和GTX的适配体。GNPs提供比色读数，允许通过消光比变化实时视觉监测文库富集，无需复杂仪器；该平台已成功应用于BL和BPA。磁性纳米粒子促进快速分离，并已集成到多种SELEX形式中，包括MB-SELEX和MRGO-SELEX，用于高效筛选针对海洋毒素的适配体。
方法创新。已开发出一系列策略来扩展SELEX的范围和效率。多靶标筛选挑战了传统的“一靶标一SELEX”范式，使得能够在单次活动中同时分离针对多个靶标的适配体。使用多重GO-SELEX，Nguyen等人获得了针对三种农药的十种不同适配体（Kd= 10-100 nM），包括能够结合两个或三个靶标的交叉反应序列。在这些方法学进展的基础上，多靶标筛选策略实现了一种独特的应用：开发能够识别整个结构相关毒素家族的广谱适配体。这种策略对于具有结构相似性的毒素家族特别有价值，为广谱识别元件提供了一条途径。
除了多靶标筛选，互补技术的集成已成为一种强大的范式，并已成功应用于各种毒素。例如，HT-SELEX与AuNP-SELEX的结合，利用高通量测序和纳米材料筛选来简化适配体发现；微流控与磁珠的集成，自动化筛选，减少轮次，并引入可调剪切力以精确控制严格性；Capture-SELEX与液滴微流控的耦合用于具有功能读出的RNA适配体筛选；以及CE-SELEX的高效率，在最少轮次内实现显著富集等。
杨朝勇团队贡献了两个值得注意的创新，桥接了SELEX方法和下游传感器集成。首先，他们开发了基于单分子乳液PCR和琼脂糖珠分离的单克隆表面展示SELEX（MSD-SELEX），实现了简单、快速和成本效益的适配体富集，无需大规模DNA测序；该方法已成功应用于AFB1。其次，他们设计了一种AFB1响应的水凝胶，集成了距离读出微流控芯片，允许在真实样品中进行便携式视觉定量检测AFB1。这些例子说明了SELEX方法学的进步如何可以直接转化为用户友好的检测设备。
总的来说，这些趋势反映了从方法导向到需求导向的适配体开发的转变，其中筛选工作流程根据靶标特性和下游应用要求进行定制——这一范式通过人工智能与HT-SELEX的融合进行从头适配体设计而进一步推进。
4.2.2. 人工智能辅助与计算设计
人工智能的集成正在将适配体发现从筛选驱动的过程重塑为设计驱动的学科。传统SELEX，即使是高通量格式，仍然受到序列空间的巨大及其对实验富集的依赖的限制。人工智能辅助方法通过学习来自HT-SELEX数据的序列-功能关系，使得能够在不需要先决结构信息的情况下从头设计。
一个代表性的进展是InstructNA框架，它结合了核酸大语言模型（NA-LLMs）与HT-SELEX数据集，直接从序列信息生成功能性适配体，产生比传统HT-SELEX显著更强的结合剂。互补的人工智能策略进一步扩展了这一范式。GRAPE-LM将NA-LLMs与细胞内CRISPR筛选数据集成，实现RNA适配体的单轮进化。SILEX是2026年报道的一种新型单轮适配体筛选策略。与多循环SELEX不同，它只执行一轮孵育，利用UMI标签消除PCR偏差，并采用UAE-Clustering机器学习从测序数据中挖掘保守的结合核心结构。初始单轮文库保留了等同于多轮富集池的完整基序信息。在预测二级结构的指导下，适配体可以被截短和突变以实现亲和力提高，大大缩短筛选周期并避免由重复扩增引起的最优序列丢失。RaptScore利用大语言模型评估任意序列——包括那些不在SELEX中的序列——适应可变序列长度，并显示出与结合活性的强相关性；当与计算机成熟集成时，它允许截短多达10个核苷酸，同时保持结合效率。
作为对人工智能辅助分析HT-SELEX数据的补充，Huang及其同事开创了计算策略，绕过或补充实验SELEX用于海洋毒素适配体发现。一项创新是“先对接后组装”方法，将单个核苷酸对接到OA并将其组装成完整的适配体序列，使得能够在没有先验SELEX富集的情况下进行从头设计。另一种策略通过分子对接筛选毒素靶标来重新利用现有的热稳定DNA适配体。与扫描巨大随机序列库的计算虚拟筛选不同，这种重新利用方法将候选空间限制在结构验证的、热稳定的DNA适配体库中，然后进行基于对接的筛选针对TTX，并进行模拟引导的工程以增强亲和力和特异性。总的来说，这些研究例证了计算化学和分子模拟如何能够减少对劳动密集型筛选的依赖，并加速小分子毒素的适配体开发。
Di Gioacchino等人报道的凝血酶适配体的典型比较案例清楚地区分了从传统SELEX和机器学习方法获得的序列：先前研究中的传统SELEX方法鉴定出强结合剂ThA和ThD。相比之下，基于RBM（人工智能驱动）的设计生成了从头序列，如r8和r9，它们经实验验证为exosite-I结合剂，证明了该模型产生不存在于原始训练数据中的功能性适配体的能力。这种对比揭示了迭代湿法SELEX的固有局限性：重复的PCR富集过滤掉低丰度的高亲和力克隆，并且未能挖掘潜在的结合基序，而生成式机器学习模型打破了初始文库多样性的约束，以预测不存在于起始池中的优越结合剂，为获得超越局部富集序列的全局最优适配体提供了可靠策略。
随着实验HT-SELEX数据集的不断增长，高通量实验与人工智能驱动分析的协同作用有望成为下一代适配体发现的基石。
除了大型人工智能模型和分子对接工具外，计算机SELEX已成为一种低成本预筛选策略，用于快速挖掘针对毒素的高特异性适配体，大幅减少湿实验室筛选轮次和试剂消耗。传统湿实验室SELEX依赖于重复的孵育、分离和扩增周期来富集候选序列，而计算机SELEX通过计算机模拟完全完成文库构建、靶标结合模拟、亲和力评分和计算机反选择以去除交叉反应候选物。该工作流程加速了适配体发现，同时提高了靶标特异性和结合亲和力。此外，计算建模能够详细的适配体-靶标分子间相互作用的三维可视化，这是传统SELEX实验无法实现的能力。Escamilla-Gutiérrez等人构建了两阶段计算机筛选管道，整合了基于序列的RPISeq预测和多程序共识分子对接。通过对大型虚拟核酸文库进行结构聚类，他们成功鉴定出针对三种关键细菌战毒素的特异性RNA适配体：葡萄球菌肠毒素B（3SEB）、霍乱毒素（1XTC）和肉毒毒素（3BTA）。Rasouli Jazi等人开发了一个完整的原始计算机SELEX框架，以筛选针对霍乱弧菌外膜蛋白OmpU的高特异性RNA适配体。分子动力学（MD）模拟验证了适配体-蛋白质复合物的稳定性，用于快速霍乱诊断，标志着针对霍乱弧菌OmpU的计算机适配体筛选策略的首个报道。然而，人工智能方法具有固有局限性。它们的预测可靠性严重依赖于训练数据集的质量和规模（通常是来自HT-SELEX的深度测序输出）。对于缺乏丰富标记结合和非结合序列数据的毒素靶标，人工智能驱动预测可能遭受显著升高的假阳性率。一个平衡的、合理的解决方案在于迭代的干湿集成：微流控或HT-SELEX实验快速生成初步富集谱，人工智能模型外推未探索的序列空间并预测关键功能突变，低通量湿测定进行靶向验证，在筛选效率和预测准确性之间实现最佳权衡。
4.2.3. 用于毒素检测的适配体工程
尽管SELEX筛选成功，实际的毒素检测面临四个瓶颈：对小分子亲和力低、复杂基质中的核酸酶降解、对痕量毒素灵敏度不足以及信号转导差。SELEX后工程——包括环化、多价组装和结构转换设计——为这些挑战提供了系统解决方案。
环化提高了亲和力和稳定性。Tan的团队开发了适配体的光化学共价锁定，将小分子毒素的结合能降低约1.4倍。Li的团队首次率先从环状DNA文库中直接筛选环状DNA适配体，产生了针对艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的两种高亲和力环状适配体——一种在环状和线性形式中都有功能，另一种仅在环状构型中活跃，证明环化本身可以产生独特的结合功能。在此基础上，他们进一步在100%人血清中直接进行进化，产生了具有高度生物稳定性的pM亲和力环状适配体，可直接应用于食品或环境基质中的毒素检测。
多价组装通过亲合力效应提高灵敏度。Tan的超级分子策略（例如金纳米簇自组装）将血清稳定性从3小时延长到48小时，这对于现场可部署的毒素传感器至关重要。
结构转换信号适配体，由Li开创，直接将靶标结合与荧光输出耦合，实现无抗体、快速的毒素检测。与滚环扩增集成产生了一种纸基装置，在16分钟内检测到0.1 nM艰难梭菌毒素B。
总之，Li的源头创新（结构转换、环状筛选）和Tan的分子工程（环化、多价）直接解决了毒素检测的关键瓶颈。
4.2.4. 其他新兴方向
其他几个方向正在扩展SELEX衍生的适配体用于毒素检测的范围。RNA适配体提供独特的结构多样性，其效用正通过化学修饰和SELMA（修饰适配体筛选）用于与PCR扩增不兼容的大体积修饰而得到推进。同时，智能手机检测与便携式适配体传感器的集成使得能够在食品和环境基质中对新兴污染物进行现场筛查。
总的来说，这些方向正在拓宽工具包，以生成针对毒素检测特定挑战量身定制的适配体。
