胞外钙离子抑制欧黄盖鲽(Platichthys flesus)尾神经分泌系统(CNSS)中S100β基因的表达

《Aquaculture and Fisheries》：The S100β gene expression repressed by extracellular calcium in the caudal neurosecretory system of the euryhaline flounder, Platichthys flesus

　　

摘要：S100β是S100蛋白家族成员，具Ca2+结合EF-hand基序，参与多种钙介导的信号通路。尽管多种S100蛋白功能及其与疾病的关系已被广泛研究，鱼类中S100β的信息仍不清楚。本研究从广盐性欧黄盖鲽(Platichthys flesus)尾神经分泌系统(caudal neurosecretory system, CNSS) cDNA文库中克隆获得S100β cDNA，其编码95个氨基酸的蛋白质，与人同源蛋白仅56.8%序列同一性。实时荧光定量PCR(qPCR)显示CNSS和脊髓是欧黄盖鲽S100β表达的主要部位。原位杂交和免疫定位显示S100β存在于大多数CNSS细胞类型中，室管膜细胞(ependymal cells)及Dahlgren细胞周围细胞信号尤强。此外，CNSS中S100β mRNA表达呈昼夜节律，淡水(freshwater, FW)适应组显著高于海水(seawater, SW)适应组。腹腔注射乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)快速诱导低血钙，注射后4 h CNSS中S100β mRNA表达显著升高；反之，注射拟钙剂(calcimimetics)降低S100β表达。上述发现为进一步探究鱼类CNSS源性S100β的生理作用奠定基础，并增进对其参与钙稳态和渗透压调节功能的理解。

论文解读：胞外钙离子抑制欧黄盖鲽(Platichthys flesus)尾神经分泌系统(CNSS)中S100β基因的表达

本文发表于《Aquaculture and Fisheries》。

一、研究背景与目的

鱼类生活于多变的水体渗透环境中，环境钙离子浓度常被用作外界盐度和离子强度的替代指标，钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)是关键的渗压感受蛋白。S100蛋白系脊椎动物特有的小分子(~10 kDa)酸性Ca²⁺结合蛋白，含EF-hand结构基序，其中S100β在哺乳动物神经系统中研究较多，可通过结合Ca²⁺发生构象改变调控细胞功能及胞内Ca²⁺稳态，但S100β在鱼类中是否参与钙调节及渗透压调节尚不清楚。尾神经分泌系统(caudal neurosecretory system, CNSS)为鱼类特有神经内分泌结构，位于脊髓末端，含大细胞神经内分泌神经元即Dahlgren细胞，可分泌尿紧张素I(urotensin I, UI)、尿紧张素II(urotensin II, UII)及甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein, PTHrP)等，参与昼夜节律、渗透压调节和钙稳态，但CNSS是否为鱼类S100β主要来源及其表达是否受环境变化调制未见报道。广盐性欧黄盖鲽(Platichthys flesus)可往返于海水与淡水，是研究渗透压应激的理想模型。本研究旨在克隆鉴定欧黄盖鲽S100β，明确其组织分布、细胞定位、昼夜节律特征及对慢性盐度挑战和急性低血钙的响应，探讨S100β在鱼类钙稳态与渗透压调节中的潜在作用。

二、主要关键技术方法

研究材料为采自英国Morecambe湾并驯养于海水(SW)或淡水(FW)水族箱的成体欧黄盖鲽(Platichthys flesus, 300–500 g)。主要技术方法包括：从SW适应鱼CNSS构建全长cDNA文库并随机测序获得S100β全长cDNA；生物信息学进行多序列比对、结构域预测及最大似然法(maximum likelihood, ML)系统发育树构建；³⁵S标记反义核糖探针进行CNSS组织原位杂交(in situ hybridization)；制备欧黄盖鲽S100β多肽抗体行免疫组织化学(immunocytochemistry)染色；实时荧光定量PCR(qPCR, TaqMan探针法)检测多组织S100β mRNA分布、CNSS昼夜节律(24 h内每3 h取样)、长期SW/FW适应后CNSS基因表达差异；腹腔注射EGTA诱导急性低血钙模型，设生理盐水对照，于0.5、1、2、4 h取CNSS检测基因表达；淡水适应鱼经埋植套管注射拟钙剂R-568或其对映体S-568(对照)，8 h后检测CNSS中PTHrP亚型B(PTHrPB)及S100β mRNA表达；血浆总钙、离子钙、渗透压、Na⁺、Cl^–等由原子吸收分光光度法、冰点渗透压测定等检测；数据以均值±标准误(SEM)表示，两组间独立样本t检验，多组间单因素方差分析(one-way ANOVA)加Tukey事后检验，P<0.05为差异显著。

三、研究结果

3.1 Molecular identification and characterization of S100β cDNAs（S100β cDNA的分子鉴定与特征分析）

研究人员从CNSS cDNA文库中获得全长747 bp的S100β cDNA(GenBank登录号PP187232)，含68 bp 5′-非翻译区(5′-UTR)、288 bp开放阅读框(open reading frame, ORF)及391 bp 3′-UTR，编码95个氨基酸蛋白质，分子量11.20 kDa，理论等电点pI 4.40，含两个保守EF-hand基序(N端第19–32位、C端第62–73位)。与橄榄鲽(olive flounder)同源性93.6%、青鳉(medaka)87.3%、人56.8%。系统发育树显示硬骨鱼单独聚为一支，哺乳类、鸟类及软骨鱼聚为另一支，表明硬骨鱼S100β存在谱系特异性分化。

3.2 Tissue distribution of S100β mRNA（S100β mRNA的组织分布）

qPCR结果显示S100β mRNA在神经组织中表达最高，尤以CNSS和脊髓最强，脑中亦有表达，血液、脾脏、膀胱及肌肉中有中等水平表达，肝脏、鳃、肾、肠中几乎检测不到，提示S100β在欧黄盖鲽中主要定位于神经系统。

3.3 Localization of S100β in the CNSS（S100β在CNSS中的定位）

原位杂交显示S100β mRNA表达于Dahlgren细胞、Dahlgren细胞周围细胞及中央管衬里的室管膜样细胞(ependymal-like cells)，后者信号最强；正义探针阴性对照无信号。免疫组化结果与mRNA定位一致，S100β免疫反应阳性见于室管膜样细胞及Dahlgren细胞周边与胞体，尿垂体(urophysis)仅有极弱信号，空白对照无染色。

3.4 The rhythms of S100β mRNA in CNSS（CNSS中S100β mRNA的昼夜节律）

海水适应鱼CNSS中S100β mRNA表达呈明显昼夜节律，白天显著上调，约09:00达峰值，夜间较低，21:00最低(P<0.05)，表明S100β表达受昼夜或生物钟调控。

3.5 Long-term acclimation to SW and FW（长期海水与淡水适应的影响）

FW适应组血浆渗透压、Na⁺、Cl^–显著低于SW适应组，尿液渗透压及尿离子钙降低，但血浆总钙与离子钙在两组间无显著差异，CNSS中CaSR mRNA也无显著变化。FW适应组CNSS中S100β mRNA表达较SW适应组显著升高(P<0.05)，提示环境盐度通过钙相关途径下调S100β表达。

3.6 EGTA-induced acute hypocalcemia（EGTA诱导急性低血钙的影响）

腹腔注射EGTA使血浆离子钙在0.5、1、2、4 h显著降低，总钙短暂升高，血浆渗透压仅2 h略升。CNSS中S100β mRNA在注射后4 h显著上调(P<0.05)，而CaSR mRNA无显著变化，表明胞外低钙可诱导CNSS中S100β转录上调。

3.7 Effects of calcimimetics on PTHrPB and S100β mRNA expression in CNSS（拟钙剂对CNSS PTHrPB和S100β mRNA表达的影响）

注射拟钙剂R-568(激活CaSR) 8 h后，CNSS中PTHrPB与S100β mRNA表达较对照组(S-568)均有下降趋势但未达统计学显著性(P>0.05)，趋势上与胞外高钙/拟钙抑制S100β表达相符。

四、讨论与结论总结

讨论指出本研究首次证实S100β存在于鱼类CNSS，主要表达于中央管室管膜样细胞及Dahlgren细胞周围细胞(可能与α神经元有关)乃至Dahlgren细胞内本身，提示S100β可能参与局部钙信号感知整合、胞内Ca²⁺缓冲及神经分泌相关的囊泡转运与胞吐调控。S100β在硬骨鱼中与哺乳类整体保守但EF-hand基序有细微种属差异，可能适应鱼类特殊渗透环境。CNSS中S100β表达受昼夜调控且与环境盐度及胞外Ca²⁺水平负相关——低血钙(EGTA)上调、高钙/拟钙趋势上下调、FW(低环境钙)适应上调而SW(高环境钙)适应下调，说明S100β是胞外Ca²⁺调控的下游效应分子，参与鱼类系统性钙稳态及渗透压调节网络，但其是否以内分泌方式释放入血尚待验证。

结论(翻译)：

综上所述，本研究证实S100β mRNA广泛分布于欧黄盖鲽，中枢神经系统特别是脊髓是其主要表达部位，S100β信号主要定位于中央管衬里室管膜样细胞及Dahlgren细胞周细胞群。欧黄盖鲽S100β表达具昼夜节律并对胞外钙离子产生响应。本研究强调了环境盐度与CNSS S100β表达间的关联，并突出离子钙在调控S100β表达中的关键作用。这些发现支持胞外钙离子抑制欧黄盖鲽(Platichthys flesus) CNSS中S100β基因表达的观点，为进一步探究鱼类S100β生理功能及理解其在钙稳态和渗透压调节中的潜在作用提供了基础。