针对microRNA-29b前体（pre-miR-29b-1）的强化重组生产：基于连续灌注培养技术

《Current Research in Biotechnology》：Intensified recombinant production of pre-miR-29b-1 through continuous perfusion cultivations

　　

近年来，RNA疗法因能够针对疾病的遗传学病因发挥作用，已成为多种人类疾病的前沿治疗方式。在这一领域中，微小RNA（microRNAs, miRNAs，非编码的15-22核苷酸单链RNA，能够进入细胞质RNA诱导沉默复合体（RISC）并与互补mRNA配对后抑制基因表达）引起了越来越多的关注。在此背景下，近期研究证实了microRNA-29b（miR-29b）下调与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）进展之间的直接相关性，推测该寡核苷酸的给药可作为该疾病的治疗手段。尽管潜力巨大，但当前主要基于体外合成（in vitro synthesis）的制造方法存在可放大性（scalability）差、环境足迹大以及最终产物给药后高免疫原性反应等缺陷。这些问题可通过pre-miR-29b-1的重组生产予以缓解。然而，迄今为止该产物仅在极小规模和极低滴度下实现报道，完全无法转化至制造规模。在本研究中，研究人员建立了转化型海洋细菌Rhodovulum sulfidophilum的连续灌注培养（continuous perfusion cultures），以实现pre-miR-29b-1的高通量重组生产。从升规模.batch培养出发，研究评估了扩增培养基中氯化钠含量的作用，揭示了盐浓度升高时微生物生长与产物释放之间的权衡关系。基于此，研究人员开发了首个pre-miR-29b-1生物制造灌注工艺，在最佳情况下使体积产能（volumetric productivity）较batch操作提高了4倍。这些成果凸显了重组技术与灌注培养相结合以可持续方式提升工艺通量的潜力。

## 研究背景与问题

基因治疗在过去三十年间逐渐兴起，成为有效应对多种严重及罕见人类疾病的强有力工具。RNA药物因其特异性与安全性而受到关注，其中miRNA能够调控多个靶基因，在癌症、调控障碍及神经退行性疾病等领域具有应用前景。研究表明，miR-29b的下调与阿尔茨海默病进展直接相关，其可通过抑制β-分泌酶1（BACE1）减少淀粉样蛋白-β肽的形成，从而成为一种有效的治疗策略。然而，当前核酸制造的主流方法——固相化学合成和体外转录（in vitro transcription, IVT）——存在可放大性差、产量有限、环境负担重等缺陷，且终产物需化学修饰以增强稳定性，但这会引入更高的免疫原性反应。

重组生物制造为此提供了有吸引力的替代方案：发酵工艺具有良好的可放大性，重组核酸可经历天然转录后修饰以降低免疫原性，且可减少有机溶剂使用并利用可再生原料。大肠杆菌（E. coli）虽是常用宿主，但其释放大量核糖核酸酶（RNases）且产物主要积累于胞内，需细胞裂解才能回收。相比之下，海洋细菌Rhodovulum sulfidophilum能够主动分泌聚合物（包括蛋白质、多糖和核苷酸），且RNases检出量极低，使目标产物可直接从培养液中回收。利用该宿主，Nagao等实现了小发夹RNA（shRNA）的胞外生产；Pereira等则报道了人pre-miR-29b的发酵法胞外生产，但最大胞外和胞内滴度分别仅达180 μg/L和360 μg/L，远不能满足产业化需求。Riscado等同样在batch摇瓶中获得了极低的pre-miR-29b-1产量。因此，亟需提升该平台的产物通量。

本研究旨在利用基因工程改造的Rhodovulum sulfidophilum菌株，建立高效可靠的pre-miR-29b-1升规模高产制造平台。这是首次报道采用人pre-miR-29b-1的升规模生物制造及灌注细胞培养，证明了该平台有效放大的可能性。

## 主要技术方法

研究人员采用的技术路线主要包括：以转化型Rhodovulum sulfidophilum DSM 1374菌株（携带pNZY28-pre-miR-29b-1质粒，含卡那霉素抗性基因、rrn启动子及核酶侧翼序列和puf终止子）为生产宿主；通过改良半限定培养基进行细胞扩增与发酵；采用50 mL旋转管（spin tubes）作为scale-down模型进行小规模半灌注操作模拟；在DASGIP平行生物反应器系统（3 L玻璃反应器，2 L工作体积）中进行batch和灌注bench-scale发酵，灌注操作通过交替切向流（Alternating Tangential Flow, ATF）细胞截留装置实现；产物经乙醇沉淀法提取后，采用离子对反相高效液相色谱（ion-pair reversed-phase HPLC）进行定量分析，使用Agilent 1200 HPLC UV-vis系统配合Agilent Advance-Bio Oligonucleotide色谱柱，检测波长260 nm。

## 研究结果

### Bench-scale batch发酵

研究人员首先进行了R. sulfidophilum的升规模batch培养。结果表明，无论规模大小，野生型（WT）细菌的OD₅₈₃均显著高于转化型（T）菌株：野生型在约300 h达到稳态期时OD₅₈₃为12.5，而转化型在100 h达到稳态时仅为2.0。这可能是由于质粒插入改变了代谢活性，或抗生素的存在影响了菌群。升规模优化（调整葡萄糖和氮源、改善通气和pH/溶解氧/温度控制）使野生型和转化型细胞密度分别提升了2.7倍和2.6倍。

预miR-29b-1在转化型菌株培养的前100 h内被主动分泌，支持了核酸作为细菌絮凝交联剂促进细胞生长的假设。产物浓度在工艺后期略有下降，可能源于降解或吸附。通过优化营养浓度，升规模batch操作达到了3400 μg/L/OD₅₈₃的平均比生产强度，较文献报道的小规模结果（0.94 μg/L/OD₆₀₀）大幅提升。但仍存在操作不连续、产物停留时间长、副产物积累等固有问题。

### 小规模半灌注模型

研究人员首次开发了pre-miR-29b-1的灌注工艺，采用旋转管模拟每日更换培养基的操作。在1 RV/d灌注率下，考察了0-50 g/L NaCl浓度范围的影响。结果显示：除0 g/L组外，各组细菌密度均随时间增加；30 g/L NaCl的灌注培养较batch培养OD₅₈₃提高2倍；最优细胞密度出现在20 g/L NaCl，与此前batch系统的最优值（30 g/L）不同，这可能归因于灌注培养维持了更稳定的渗透压和葡萄糖水平。

产物检测表明，除最低NaCl浓度外，各组均持续表达pre-miR-29b-1，且产物产量随NaCl浓度单调递增，在最高浓度时达到最大。这提示存在高渗诱导裂解促进胞内产物释放的机制。由此揭示了细胞生长与产物产量之间的权衡：低盐（20 g/L）利于生长，高盐利于产物释放。

### Bench-scale灌注生物制造

研究人员将工艺放大至升规模，采用ATF中空纤维膜过滤模块进行细胞截留，考察了20 g/L和30 g/L NaCl配合0.5 RV/d，以及30 g/L NaCl配合0.7 RV/d的条件。结果验证了小规模模型的发现：20 g/L NaCl组较30 g/L NaCl组（0.5 RV/d）细胞密度高约30%；而固定30 g/L NaCl时，提高灌注率至0.7 RV/d使OD₅₈₃从9提升至12。灌注培养维持了15-20 g/L的稳态葡萄糖浓度。产物浓度在约200 h（指数生长期）达到峰值，证实pre-miR-29b-1作为初级代谢产物的特性。30 g/L NaCl灌注组的产物滴度高于20 g/L组，与小规模结果一致。

### 性能比较

各工艺的关键绩效指标（KPIs）比较显示：20 g/L NaCl灌注组体积产能最低（0.35 mg/L/d）、培养基消耗最高，最不经济；30 g/L NaCl、0.5 RV/d灌注组产能提升至3.73 mg/L/d；进一步将灌注率提高至0.7 RV/d，体积产能达4.78 mg/L/d，较batch培养提高4倍。各30 g/L NaCl组的培养基消耗无显著差异。

## 结论

研究表明，重组技术与灌注培养的结合可显著提升pre-miR-29b-1的生产效率。最优工艺（30 g/L NaCl，0.7 RV/d灌注率）实现了4倍于batch的体积产能提升，为核酸类生物治疗药物的可持续制造奠定了基础。该研究发表于《Current Research in Biotechnology》，标志着人pre-miR-29b-1的首次升规模重组生产，以及该产物灌注生物制造的首次报道。未来进一步优化灌注率和培养基组成，有望实现更高的生产强度和经济性。