马缨丹(Lantana camara L., Verbenaceae)通过靶向α7 nAChR变构位点及抑制嗅–记忆轴的氧化–炎症级联反应减轻缺血诱导的嗅觉功能障碍

《IBRO Neuroscience Reports》：Lantana camara L. (Verbenaceae) attenuates Ischemia-induced olfactory dysfunction by targeting the α7 nAChR allosteric site and mitigating oxidative-inflammatory cascades in the rat olfactory-memory axis

　　

背景： 嗅觉功能障碍是缺血性卒中常见却研究不足的后遗症，目前尚无获批药物。尽管喀麦隆民族医药有用马缨丹(Lantana camara L.)治疗卒中后遗症的记载，其对缺血致嗅–记忆轴损伤的保护作用尚不清楚。 目的： 建立可重复的卒中后嗅觉功能障碍大鼠模型，评价马缨丹叶水提物(AELC)对全脑缺血再灌注所致嗅–认知缺损的神经保护作用。 方法： 通过双侧颈总动脉及颈内动脉夹闭建立雄性Wistar大鼠短暂性全脑缺血再灌注(Transient Global Cerebral Ischemia-Reperfusion, TGCI-R)模型。动物予AELC(140、280、560 mg/kg)、米诺环素(minocycline, 100 mg/kg)或吡拉西坦(piracetam, 250 mg/kg)阳性对照灌胃。评估神经功能恢复、体温变化、嗅–认知行为学(埋食实验、新异气味识别、空间气味记忆)、嗅球(OB)、梨状皮层(PC)、前额叶皮层(PFC)及海马(Hippocampus)生化指标(乙酰胆碱ACh、丙二醛MDA、亚硝酸盐NO2?、还原型谷胱甘肽GSH、IL-1β、TNF-α)及组织学改变。通过LC-MS定性、SwissADME预测药物相似性(ADMET)、ProTox-3.0毒性预测及盲对接分子对接(α7 nAChR, PDB: 7KOX)探究机制。 结果： 缺血再灌注致严重体温调节障碍、运动缺陷及显著嗅觉功能障碍(Hedges' g > 2.00)，伴ACh耗竭、氧化应激(MDA及亚硝酸盐升高，GSH耗竭)与神经炎症(IL-1β及TNF-α升高)，组织学见神经元固缩、鬼影细胞形成及微结构紊乱。AELC 280和560 mg/kg有效逆转上述缺陷，恢复胆碱能张力(p < 0.001)并保存神经元微结构，效果与阳性药相当。LC-MS及计算机模拟鉴定圣草素(Salvigenin)和基格林酮(Kigelinone)为潜在活性成分，符合Lipinski规则且膜通透性良好；基格林酮与α7 nAChR跨膜区M2螺旋Ala262形成氢键，结合位点与已知变构调节剂拓扑一致，提示其可能作用于α7 nAChR变构位点。 结论： 研究建立了可靠的卒中后嗅觉功能障碍大鼠模型，证实马缨丹通过调节胆碱能–抗氧化–神经炎症轴发挥显著神经保护作用，验证其民族药用价值，并为开发靶向缺血性卒中的天然产物 scaffold提供依据。

论文解读：《Lantana camara L. (Verbenaceae) attenuates Ischemia-induced olfactory dysfunction by targeting the α7 nAChR allosteric site and mitigating oxidative-inflammatory cascades in the rat olfactory-memory axis》

该研究发表于《IBRO Neuroscience Reports》。目前卒中后嗅觉功能障碍(post-stroke olfactory dysfunction)发生率高达20%~70%，却无获批药物治疗，且发展中国家缺乏专科卒中单元。嗅球(olfactory bulb, OB)、梨状皮层(piriform cortex, PC)、前额叶皮层(prefrontal cortex, PFC)及海马(hippocampus)构成嗅–记忆轴(olfacto-mnemonic axis)，对缺血敏感，缺血后再灌注引发乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)耗竭、氧化应激与神经炎症致神经元死亡。马缨丹(Lantana camara L.)在喀麦隆等地民间用于治疗卒中后遗症，但其对嗅–记忆轴缺血损伤的作用未见报道。研究人员旨在建立标准化大鼠缺血后嗅觉障碍模型，并评价马缨丹水提物(aqueous extract of L. camara, AELC)的神经保护效应及机制。研究发现AELC 280和560 mg/kg可显著逆转缺血再灌注所致的嗅–认知缺陷，恢复胆碱能张力、抑制氧化–炎症级联并保存神经元结构，LC-MS结合分子对接提示 Salvigenin 和 Kigelinone 可能作为α7 烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7 nAChR)变构调节剂发挥作用，验证了民族药用合理性，为植物源神经保护剂开发提供临床前依据。

主要关键技术方法：

研究人员采用雄性Wistar大鼠(n=7~54依分组)，经双侧颈总动脉及颈内动脉夹闭15 min建立短暂性全脑缺血再灌注(transient global cerebral ischemia-reperfusion, I/R)模型，术前后监测直肠温度筛选造模成功动物。术后剔除无嗅觉缺损个体，随机分为假手术(sham)+蒸馏水、I/R+蒸馏水(阴性对照)、I/R+米诺环素(minocycline, 100 mg/kg)、I/R+吡拉西坦(piracetam, 250 mg/kg)及I/R+AELC(140、280、560 mg/kg，口服灌胃，每日1次×7 d)。行为学包括改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score, mNSS)、旷场实验(open field test, OFT)、埋食实验(food buried-seeking test, FBST)、新异气味识别(novel odor recognition, NOR)及空间气味记忆(spatial odor memory test, SOMT)。处死后取OB、前/后PC、PFC及海马制备匀浆，测定ACh(比色法)、MDA(TBA法)、亚硝酸盐(Griess反应)、GSH(Ellman's试剂)及IL-1β/TNF-α(ELISA)；另取组织行H&E染色半定量病理评分(双盲)。AELC经LC-MS鉴定成分，SwissADME做Lipinski五规则与BOILED-Egg膜通透预测，ProTox-3.0预测神经/肝毒性，CB-Dock2做α7 nAChR(PDB:7KOX)盲对接分子对接。

研究结果

3.1. Variation of body temperature during cerebral ischemia induction

I/R组术中核心体温降幅最大(约3.00%)并出现再灌注后代偿性高热，而假手术组仅轻度一过性降温后恢复。体温失稳被用作造模成功的生理指征。

3.2. Effect of common and internal carotid arteries occlusion on the neurological score, spontaneous locomotion and exploration in the open arena, and food buried seeking tasks

I/R大鼠mNSS显著升高，旷场总路程、平均速度及移动时间显著降低，埋食潜伏期显著延长而可见食物寻找仅轻度受损，证实模型产生特异性嗅觉缺损伴广泛神经运动障碍。

3.3. Effect of the aqueous extract of L. camara on the neurological deficits score

AELC 280 mg/kg组mNSS改善最显著(p < 0.001 vs I/R)，AELC 560 mg/kg亦显著改善，效果与minocycline相当，piracetam组未达统计学显著性。

3.4. Effect of the aqueous extract of L. camara on the exploratory and locomotor activity in the open field

各AELC剂量均恢复I/R所致旷场活动抑制(p < 0.001 vs I/R)，AELC 280 mg/kg对平均速度和移动时间的恢复接近minocycline水平。

3.5. Effect of the aqueous extract of L. camara in the food-buried-seeking test

AELC各剂量及阳性药显著缩短埋食潜伏期(p < 0.001 vs I/R)，其中piracetam与AELC 140 mg/kg改善幅度最大，表明AELC恢复嗅觉驱动的食物搜寻能力。

3.6. Effect of the aqueous extract of L. camara on the novel odor recognition test

I/R组新异气味探索时间及偏好指数(preference index, PI)显著降低；AELC 280 mg/kg使探索时间较I/R增加4.50倍，AELC 560 mg/kg使PI恢复至接近假手术组水平(p < 0.01 vs I/R)。

3.7. Effect of the aqueous extract of L. camara on the spatial odor memory

I/R组空间气味记忆辨别指数(discrimination index)及探索距离显著降低；AELC 560 mg/kg使辨别指数较I/R提高3.22倍(p < 0.001)，效果优于或等同于阳性对照。

3.8. Effect of the aqueous extract of L. camara on the levels of acetylcholine in the olfactory bulb, piriform cortex, prefrontal cortex, and hippocampus

I/R致四脑区ACh显著耗竭(海马最甚降至假手术41.6%)；AELC 560 mg/kg在各脑区恢复ACh至假手术约73%~100%(p < 0.001 vs I/R)，证实胆碱能系统修复。

3.9. Effect of the aqueous extract of L. camara on nitrites, MDA, and GSH levels

I/R致各脑区亚硝酸盐与MDA升高、GSH降低；AELC(尤280 mg/kg对亚硝酸盐与GSH，140 mg/kg对MDA，560 mg/kg对海马MDA)显著回调上述指标(p < 0.01~0.001 vs I/R)，部分降至低于假手术基线，表明抗氧化与抗亚硝化作用。

3.10. Effect of the aqueous extract of L. camara on TNF-α and IL-1β levels

I/R致四脑区TNF-α与IL-1β显著升高；AELC 280 mg/kg(梨状皮层TNF-α降52%)和AELC 560 mg/kg(前额叶IL-1β降约59%)显著抑制促炎因子(p < 0.01~0.001 vs I/R)，接近或低于假手术水平。

3.11. Effect of the aqueous extract of L. camara on the histology of the olfactory bulb, piriform cortex, prefrontal cortex, and hippocampus

I/R见OB、PC、PFC及海马CA1/CA3/齿状回(dentate gyrus, DG)神经元丢失、鬼影细胞、空泡化及结构紊乱；AELC 280和560 mg/kg减轻至近正常(评分0~1)，保存神经元微结构，效果同阳性对照，组间评分者一致性κ=0.60~0.92。

3.12. Compounds identified from the extract of L. camara

LC-MS从AELC中鉴定6种成分类：α-蒎烯(alpha-pinene)、圣草素(Salvigenin)、山嵛酸(behenic acid)、十三烷(tridecane)、基格林酮(Kigelinone)及苦瓜素(Charantin, β-sitosteryl glucoside/5,22-stigmasteryl glucoside混合物)。

3.13. Drug-likeness, membrane permeance, and predicted toxicity of phytoactive constituents of L. camara aqueous extract

Salvigenin与Kigelinone零Lipinski违规、高GI吸收及高血脑屏障(blood–brain barrier, BBB)通透预测、无神经毒性(ProTox-3.0)；Kigelinone警示潜在肝毒性待体内验证，二者被选为最优先导化合物。

3.14. In silico identification of the α7 nAChR transmembrane vestibule as a high-affinity target for L. camara phytochemicals

盲对接显示Kigelinone结合α7 nAChR(PDB:7KOX)跨膜域囊腔(亚单位界面)，对接能?7.5 kcal/mol(优于参比PNU-120596 ?7.3 kcal/mol)，与M2螺旋Ala262(链A)形成氢键(2.67 ?)并具π-π堆积；Salvigenin ?7.2 kcal/mol。结合位点与已知α7正变构调节剂(allosteric modulator)一致，提示Salvigenin/Kigelinone可能作用于α7 nAChR变构位点。

讨论与结论翻译：

研究人员讨论指出，15分钟双侧颈总+颈内动脉夹闭I/R模型可靠诱发嗅–记忆轴缺血损伤及嗅觉缺损，体温失控(再灌注高热)是二次损伤标志。行为–生化–组织学三联证据链表明I/R致ACh耗竭、ROS爆发(MDA/亚硝酸盐↑, GSH↓)及促炎因子上调引发神经元死亡；AELC通过抗氧化、抗炎及胆碱能系统恢复减轻损伤，280~560 mg/kg效果可比minocycline/piracetam。水提液中非极性成分靠皂苷类(如Charantin)胶束增溶存在于水相。Salvigenin(黄酮)与Kigelinone(萘醌)具最佳药物相似性与BBB通透预测，分子对接提示其为潜在α7 nAChR变构位点配体，有待电生理学验证。局限含组织学n=4为描述性、缺免疫组化标记、缺激光多普勒血流定量、缺单体化合物绝对定量及批次一致性分析。

结论： 本研究建立并验证了15分钟全脑缺血再灌注诱导的大鼠卒中后嗅觉功能障碍模型，证明马缨丹叶水提物通过调节胆碱能–抗氧化–神经炎症轴对嗅–记忆轴发挥显著神经保护作用，其效应与阳性对照相当。LC-MS及分子对接鉴定Salvigenin和Kigelinone为潜在α7 nAChR变构位点作用配体。结果支持喀麦隆等地马缨丹民族药用实践，并为开发靶向缺血性脑损伤及胆碱能相关神经退行性疾病的天然产物scaffold提供临床前依据。