《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Profiling of Bacillus thuringiensis Biopesticides: A High-Resolution LC–MS/MS Approach for Subspecies Identification and Protein Quantification
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有机农业中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)源生物农药的广泛使用带来了挑战，即施用后处理样品及环境中杀虫蛋白浓度的数据有限。为此，研究人员建立了一种LC–HR–MS/MS–平行反应监测(Parallel Reaction M
有机农业中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)源生物农药的广泛使用带来了挑战，即施用后处理样品及环境中杀虫蛋白浓度的数据有限。为此，研究人员建立了一种LC–HR–MS/MS–平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring, PRM)方法，用于鉴定和定量来自苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bt subsp. kurstaki)、阿扎怀亚亚种(Bt subsp. aizawai)和以色列亚种(Bt subsp. israelensis)的晶体蛋白(crystal proteins, Cry/Cyt)。研究人员基于非靶向分析筛选标志肽(marker peptides)，并使用稳定同位素标记(stable-isotope-labeled, SIL)标准品验证其亚种区分能力与定量性能。该方法在不同基质中表现出高灵敏度(ng/g级)、良好的重复性精密度与选择性。将该方法应用于经Bt生物农药处理的罗勒(basil)植株，证实了其对亚种的准确鉴定与蛋白的准确定量。本方法通过提供处理样品中Bt毒素的定性与定量数据，支持产品质量控制与环境安全评估，弥补了现有方法的局限性，是一种稳健的分析工具。
论文解读：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)生物农药亚种鉴定与杀虫晶体蛋白定量的高分辨LC–MS/MS–PRM方法学研究
【研究背景与意义】
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是蜡样芽孢杆菌群(Bacillus cereus group)中能产杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, Cry及Cyt蛋白，又称δ?内毒蛋白)和营养期杀虫蛋白(Vip/Sip)的革兰氏阳性菌，其商品化制剂是目前应用最广的生物农药，具靶标专一性强、对非靶标生物及环境相对安全的特点。欧洲食品安全局(EFSA)在肯定授权使用下Bt生物农药总体安全的同时，指出目前存在两大数据缺口：(i)施药后环境中Bt毒素暴露水平及对非膳食接触人群(居民、旁观者、施药者)的潜在健康风险评估数据不足；(ii)因缺乏施药后环境中杀虫蛋白危害表征与暴露信息，难以评估其对非靶标陆生与水生生物的潜在风险。要评估环境暴露，须按Bt亚种和菌株量化Cry蛋白含量，这需要高灵敏、高特异性的分析方法。现有DNA?based方法(如PCR、基因组测序)可鉴定cry/cyt基因但不能反映蛋白表达水平；反相高效液相色谱(RP?HPLC)与离子交换色谱无法区分序列相似的Cry蛋白；酶联免疫吸附试验(ELISA)虽较特异但常存在交叉反应、基质效应强及多重检测能力弱等问题；已有LC–MS/MS研究多侧重蛋白鉴定而非绝对定量，且未能通过特征肽同时实现亚种鉴别。鉴于此，研究人员开发了靶向高分辨LC–MS/MS?平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring, PRM)方法，选用苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bt subsp. kurstaki)、阿扎怀亚亚种(Bt subsp. aizawai)和以色列亚种(Bt subsp. israelensis)三种欧盟授权常用亚种，结合稳定同位素标记(stable?isotope?labeled, SIL)肽段内标，在一次进样中完成亚种鉴别与晶体蛋白绝对定量，并优化样品前处理流程以适应Bt商品制剂及施药后植物基质分析。该研究成果发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》。
【主要关键技术方法】
研究人员收集市售含Bt subsp. kurstaki（LepinoxPlus、Solabiol Zünsler? & Raupenfrei等）、Bt subsp. aizawai（Xentari RaupenFrei等）及Bt subsp. israelensis（VectoBac等）的生物农药产品，以及DSMZ保藏的对应Bt标准菌株进行晶体蛋白纯化。采用50 mM碳酸氢铵+10 mM二硫苏糖醇(DTT, pH 10.5)提取可溶性蛋白，经Vivaspin 6 10 K超滤离心浓缩富集，丙酮沉淀后以RapiGestTMSF助溶，加入马心肌红蛋白脱血红素(apomyoglobin)作消化内标，依次还原( DTT)、烷基化(碘乙酰胺,IAA)、胰蛋白酶(trypsin)酶解，固相萃取(Stage?tip, SDB?XC膜)纯化肽段。先以数据非依赖采集(Data?Independent Acquisition, DIA, SONAR模式)对Bt商品制剂、菌株纯化晶体蛋白及施药后植物样品进行非靶向蛋白鉴定，筛选各亚种独有及共有高丰度胰酶肽作为标志肽(marker peptides)；通过UniProt BLAST验证特异性，用Skyline优化碰撞能量(Collision Energy, CE)与选择5个最丰富碎片离子跃迁(transitions)，对定量肽加入对应SIL肽内标建立校准曲线(3.35 fmol/μL～42950 fmol/μL)。采用Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱分离，Xevo G2 XS QTOF进行高分辨PRM检测，MassLynx?Skyline接口方法开发，Skyline及TargetLynx数据处理。将Bt生物农药按厂家推荐浓度喷施于罗勒(basil)植株，5 d后取样按同上流程提取、酶解、PRM检测验证实际应用能力。
【研究结果】
3.1. Identification of Crystal Proteins for Bt spp. kurstaki, aizawai, and israelensis（Bt库斯塔克、阿扎怀亚及以色列亚种晶体蛋白的鉴定）
研究人员通过UniProtKB检索并结合非靶向DIA分析Bt菌株纯化晶体蛋白及施药后商品制剂，鉴定出各亚种主要晶体蛋白：Bt subsp. israelensis含Cry4Aa、Cry4Ba、Cry11Aa；Bt subsp. kurstaki含Cry1Ac(主)、Cry2Aa、Cry2Ab；Bt subsp. aizawai含Cry1Ad、Cry1Ca、Cry1Da，其中Cry1Aa与Cry1Ab为kurstaki与aizawai共有。菌株ABTS?351与EG?2348间及在罗勒、欧芹、拉维纪草(lovage)、薄荷等不同植物基质中蛋白谱无差异，表明无明显基质效应。
3.2. Development of Targeted Parallel Reaction Monitoring (PRM) Method（靶向平行反应监测(PRM)方法的建立）
基于DIA数据，为每个亚种选定性(unique)标志肽：Bt subsp. israelensis选Cry4Aa/Cry4Ba共有肽及Cry11Aa特有肽；Bt subsp. aizawai选Cry1Ca与Cry1Da特有肽；Bt subsp. kurstaki选Cry1Ac特有肽。定量(shared)标志肽选Cry1Aa/Cry1Ab共有肽ELEYFPETDK(覆盖kurstaki与aizawai的Cry1类蛋白)、GNSNYFPDYFIR(覆盖kurstaki的Cry2Aa/Cry2Ab)，Bt subsp. israelensis分别用TVDVFPDTDR(Cry4Aa/Cry4Ba)与TEVETLINQK(Cry11Aa)作定量肽。所有定量肽均合成对应SIL标准品加入PRM方法，启用目标增强(target enhancement)模式提高灵敏度，apomyoglobin作酶解与纯化过程内标。
3.3. Method Validation（方法验证）
3.3.1. Evaluation of Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantification (LOQ)（检出限与定量限评估）
以空白罗勒基质加标测定，各定量肽LOD为0.17 ng/g(Cry1Aa/Ab共有肽ELEYFPETDK)～10.41 ng/g(Cry2Aa/Ab共有肽GNSNYFPDYFIR)，LOQ为0.65 ng/g～34.36 ng/g，均达ng/g级高灵敏度。
3.3.2. Evaluation of Repeatability Precision（重复性精密度评估）
低(40 fmol/μL)、高(850 fmol/μL)两浓度水平各6次重复，相对标准偏差(Sr)为0.7%～4.5%，显示良好重现性。
3.3.3. Selectivity of Marker Peptides（标志肽选择性评估）
经UniProt BLAST与实验验证，定性标志肽仅在对应亚种Bt生物农药中呈阳性，近缘蜡样芽孢杆菌群成员Bacillus mycoides及产昆虫毒素的Lysinibacillus sphaericus均无假阳性；共有定量肽在含对应Cry家族的Bt产品中阳性，不含该家族则阴性，证实高选择性。高分辨QTOF的质量精度(<1 ppm)与分辨率(>30,000 FWHM)进一步保障定性确证能力。
3.4. Application of Targeted LC–MS/MS–PRM Method to Treated Plant Material（靶向LC–MS/MS–PRM方法在施药植物材料上的应用）
四种市售Bt生物农药按推荐浓度喷施罗勒，PRM检测确认亚种与标签声明一致。LepinoxPlus(Bt subsp. kurstaki)与Solabiol(Bt subsp. kurstaki)可定量Cry1Aa/Ab共有肽(分别为0.90±0.04 ng/g与3.10±0.01 ng/g)，Cry2Aa/Ab低于LOD；Xentari RaupenFrei(Bt subsp. aizawai)可定量Cry1Aa/Ab共有肽(0.70±0.01 ng/g)并检出Cry1Ca与Cry1Da定性信号；VectoBac(Bt subsp. israelensis)定量得Cry4Aa/Cry4Ba为1.2±0.04 ng/g、Cry11Aa为0.12±0.00 ng/g。不同kurstaki菌株(Solabiol所用ABTS?351 vs LepinoxPlus所用EG?2348)表现出Cry1A表达量差异，与文献报道kurstaki分离株cry1型基因更丰富的结论一致。
【讨论与结论总结】
研究人员成功建立并验证了基于高分辨LC–MS/MS?PRM联用稳定同位素标记(SIL)肽段的Bt生物农药分析方法，可一次性完成Bt subsp. kurstaki、subsp. aizawai与subsp. israelensis的亚种鉴别及主要杀虫晶体蛋白的绝对定量。方法经非靶向DIA筛选标志肽，在植物基质中LOD达ng/g级、重复性好、选择性经近缘菌种验证无交叉反应，优化的蛋白富集前处理使其适用于Bt商品制剂及施药后植物样品。实际施药罗勒样品检测证实方法能准确匹配产品标注亚种并定量Cry蛋白残留，可揭示不同菌株间表达差异。当前方法聚焦三种欧盟常用Bt亚种，可通过增补标志肽扩展至其他亚种；未涵盖土壤、地表水等复杂环境基质，后续需开发对应基质的前处理策略。该方法为Bt生物农药质量管控(亚种真实性核查、批次蛋白含量一致性监测)及环境风险评价中暴露表征(按亚种/菌株提供Cry蛋白残留定量数据)提供了可靠、特异且可标准化的分析工具。
