《Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology》：Solving the Puzzle of Hans’ Algorithm (HA) Methodological Shortcomings: Canadian Harmonization of Hans’ Algorithm for Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) and Development of Fit-for-Purpose Modified Hans’ Algorithm (mHA)
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Hans算法（HA)是当今最为广泛应用的通过细胞起源（COO）将弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）分为生发中心B细胞（GCB）亚型与非GCB亚型的替代性生物标志物分型方案。该算法最初发表时针对基因表达谱（GEP）亚型的阳性预测值（PPV）与阴性预测值（NPV）均
Hans算法（HA)是当今最为广泛应用的通过细胞起源（COO）将弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）分为生发中心B细胞（GCB）亚型与非GCB亚型的替代性生物标志物分型方案。该算法最初发表时针对基因表达谱（GEP）亚型的阳性预测值（PPV）与阴性预测值（NPV）均未达到理想水平，且在已发表文献中未能完全重现。此外，HA在临床实践中的实际表现亦缺乏充分认知。加拿大病理学家协会高复杂度检测国家标准委员会（CAP-ACP NSCHCT)发起了一项全国性项目，旨在评估HA在临床实践中的当前诊断准确性，协调化用于HA的免疫组织化学（IHC）检测的分析阶段，并优化其对GEP亚型的总体诊断灵敏度与特异度。研究人员将经GEP（Lymph2CX, NanoString technologies)明确COO的DLBCL队列（n=96)分为训练皇帝（TC, N=45)与验证队列（VC, N=51)，并分别构建组织微阵列（TMA-TC与TMA-VC)。加拿大主要实验室采用其常规CD10、Bcl-6及MUM1 IHC方案进行染色，并将染色切片送至参考实验室复核。各实验室IHC方案依据其总体分析灵敏度被指定为"弱"（1/10)、"中等"（4/10)或"强"（5/10)。中央复核的HA判读结果与GEP结果进行比较。此外，在TC中对原始HA判读进行调整以适应总体IHC方案分析灵敏度。新的判读标准亦在VC中加以评估。原始HA判读仅对低灵敏度方案显示出良好的GEP符合率。对于具有中等及高分析灵敏度的其他实验室，将判读调整至更高IHC方案分析灵敏度，采用>30%的>2+染色强度作为cut-off值。该种改良显著提高了诊断准确性，且无需对IHC方案进行任何改动，并可广泛适用于当前使用的IHC方案分析灵敏度范围。HA的IHC生物标志物可实现高度准确并在不同实验室间协调化，以满足临床应用需求，前提是满足以下标准：（i）检测实验室使用标准化参考物质建立并监测分析灵敏度，以及（ii）病理医师的判读与cut-off值调整至与总体IHC方案分析灵敏度相匹配。
## 研究背景与问题提出
弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型，具有侵袭性临床经过。DLBCL在临床表型、形态学谱系及分子发病机制方面呈现高度异质性。该肿瘤分子分型的首次突破基于与正常参考B细胞的转录组相似性，识别出生发中心B细胞（GCB）亚型与活化B细胞（ABC）亚型，以及少数未能归类的病例。现已明确，GCB与ABC亚型是两种截然不同的疾病，具有不同的发病机制、遗传学异常及对治疗的潜在差异性反应。DLBCL-ABC型患者接受常规利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱及泼尼松（R-CHOP）方案治疗时，总体生存期（OS)与无进展生存期（PFS)均劣于GCB型。亚型间的致癌机制差异为靶向治疗的发展奠定基础，显著改善了ABC型DLBCL患者的OS与PFS。此后，基于突变特征建立了遗传学分型体系，包括GenClass算法、LymphGen算法、Dana-Farber癌症研究所分类及LymphPlex算法等，尽管这些分类系统之间存在显著重叠。
国际共识分类（ICC）与世界卫生组织（WHO）分类均认为，COO分型尚不足以充分捕捉这些肿瘤的遗传多样性，尤其与患者预后及治疗选择相关；但两类分类系统仍推荐报告COO。因此，在临床实验室中实施标准化且可重复的检测对于DLBCL的COO基础亚型分类至关重要。基于Affymetrix芯片的GEP检测是DLBCL原始GCB与ABC亚型分类的基础，但其在临床实验室的应用面临诸多实际挑战，包括新鲜组织的可获得性、复杂生物信息学支持的高端技术平台、较长的周转时间及高昂的运营成本。尽管距原始Affymetrix芯片GEP发表已逾25年，新技术已可在甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织上进行GEP检测，但这些技术均未能在常规实践中推广。取而代之的是，Hans及其同事于2004年建立了一套基于免疫组织化学的替代系统，至今仍广泛应用于临床实践。该团队证实，联合应用脑啡肽酶（CD10)、B细胞淋巴瘤6（BCL6)及多发性骨髓瘤癌基因1/干扰素调节因子4（MUM1/IRF4)这一较小的IHC检测组合，可实现对分子亚群的合理准确预测。Hans算法决策树虽不能识别"不可分类"组，但对GCB组显示87%的阳性预测值，对non-GCB组显示73%的阳性预测值。后续研究尝试通过增加额外IHC标志物或采用不同标准来改良Hans算法；然而，得益于其简便性，HA已成为该领域最常用的IHC算法。
尽管如此，自2004年发表以来，基于HA的DLBCL的COO分类IHC检测尚未在临床实验室间实现标准化统一采用。绝大多数实验室将其现有的CD10、Bcl-6及MUM1诊断性实验室自建检测（LDT)重新定位为HA预后性IHC检测，却缺乏针对临床结局或GEP进行验证的机会。非标准化IHC方案（抗原修复、一抗克隆及检测系统)以及病理医师非标准化判读/评分所导致的差异，被认为是HA缺乏可重复性及其诊断准确性不足的原因。Lunenburg淋巴瘤生物标志物联盟评估了包括CD10、BCL6及MUM1在内的多项COO分类IHC检测，8个参与实验室间的COO一致性仅为57%，κ系数为0.36。另一项研究中，Hans、Choi及Tally算法与匹配新鲜冷冻组织Affymetrix微阵列GEP结果的一致性率为59%-65%。因此，临床实验室不应未经适当验证就将诊断性IHC检测直接用于HA，IHC方案及病理医师评分/判读均需针对此特定用途进行验证。
近十年来，利用FFPE组织在自动化平台上进行GEP分析的技术迅速发展。Scott等采用FFPE样本数字RNA定量技术，定义了经精确验证的20基因检测法用于DLBCL的COO亚型分类，并以Affymetrix平台加以验证。部分将FF/PE组织GEP与基于IHC的HA进行比较的研究中，未尝试改良IHC方案或判读以提升IHC分类的性能。此外，在与GEP分类进行比较时，恰当指出此类研究的局限性在于排除了GEP未分类病例，而部分研究仅提供训练队列结果，可能高估缺少验证队列结果时的准确性。
## 研究目的与技术方法
该研究旨在识别当前报告方案及病理医师判读的薄弱环节，并探索3项IHC检测分析阶段的改变能否改善HA对GEP分类的结果。与以往部分研究不同，该研究同时检测了探索性队列与验证队列，并将GEP未分类病例纳入计算。若成功，研究结果将直接适用于当前病理实践，实现快速临床转化，并可能更准确地筛选出可从ABC型DLBCL靶向治疗中获益的患者。
本研究为加拿大病理学家协会高复杂度检测国家标准委员会（CAP-ACP NSCHCT)发起的质量保证（QA)项目，包含两大核心目标：(a)评估加拿大主要临床实验室当前HA的诊断准确性，以Lymph2Cx为金标准；(b)协调化IHC染色方案及报告以改善DLBCL的COO相关诊断准确性。
样本来源于96例确诊DLBCL患者的FFPE诊断组织，COO由GEP（Lymph2CX, NanoString technologies)确定。DLBCL诊断准确性由2名血液病理医师（E.T.和A.M.)进行中央复核确认。患者分为训练队列（TC, n=45)与验证队列（VC, n=51)，分别构建TMA-TC与TMA-VC。同时制备了3项检测的免疫组织化学关键检测性能控制品（iCAPCs)。
**主要关键技术方法包括：**（1）多中心IHC染色与评估：10家加拿大主要医学中心实验室参与第一阶段，各实验室采用其常规CD10、Bcl-6及MUM1 IHC方案对TMA切片染色，切片送至参考实验室复核；（2）基于iCAPCs的IHC方案分析灵敏度描述性分级：通过标准化组织控制品将各实验室IHC方案分为"弱"、"中等"、"强"三个等级，用于评估整体分析灵敏度；（3）两种判读方案比较：原始Hans算法判读（OHAR)与强度-改良Hans算法判读（IMHAR-1)，后者采用30% cut-off且≥2+强度为阳性；（4）Lymph2Cx GEP检测：采用NanoString数字基因表达分析平台进行20基因编码组检测，通过LLMPP网站进行生物信息学COO分类；（5）训练-验证队列设计：TC中建立改良方案，VC独立验证改良判读标准的有效性。
## 研究结果
**队列特征与Lymph2Cx分类结果**
96例初治DLBCL非特指型样本分为训练队列（n=45)与验证队列（n=51)。两组在年龄、性别、分期及其他临床特征方面具有可比性。共58例男性与38例女性患者（男:女=1.52:1)，中位年龄74岁。所有样本经Lymph2Cx算法分为ABC、GCB及不可分类（UC)。Lymph2Cx检测将50例（52%)归为GCB，38例（40%)归为ABC，8例（8%)归为UC。
**总体性能与方案分层效应**
总体而言，弱IHC方案采用原始评分（OHAR)时表现最佳。改良评分（I-MHAR)改善了中等及强IHC方案的诊断准确性，但使弱方案结果变差。IMHAR在TC与VC中均实现改善，且VC结果优于TC。
**训练队列中GCB亚型的诊断性能**
采用OHAR及原始IHC方案时，TC中GCB的阳性预测值（PPV)范围为68%-95%。OHAR下最高PPV由分析灵敏度最低的实验室实现，而强方案获得最低PPV。尽管强方案在TC中对GCB的诊断灵敏度略高，但PPV较低归因于与弱方案相比显著降低的诊断特异度。应用改良判读（I-MHAR)后，弱方案灵敏度从84%降至68%，特异度自95%微变为100%，总体诊断准确性降低。然而，I-MHAR改善了中等及强方案的诊断准确性。
**训练队列中非GCB/ABC亚型的诊断性能**
对于TC中的non-GCB/ABC，由于三阴性病例被指定为non-GCB，弱方案在OHAR与I-MHAR下灵敏度相同，但I-MHAR使特异度自79%降至63%，总体诊断准确性自87%降至78%。I-MHAR改善了TC中中等及强方案non-GCB/ABC的诊断准确性。
**验证队列中的诊断性能验证**
在VC中，尽管实现了IHC方案的整体协调化，OHAR未能反映方案改进。但应用I-MHAR后，所有实验室GCB及ABC的灵敏度与特异度均超过90%。VC中I-MHAR的诊断准确性GCB为92%-98%，non-GCB/ABC为85%-90%，后者仍优于OHAR下的67%-83%。
## 讨论与结论
**HA分析灵敏度与判读标准的历史演变**
Hans等原始报告发表于20余年前，若干技术细节描述不足，且众多后续研究对其临床相关性及与GEP的一致性提出挑战。尽管如此，得益于其简便性及广泛应用的可获得性，HA仍是COO亚型分型的首选。该研究发现，分析灵敏度最低的方案采用原始HA判读（30%阳性细胞，1+及以上强度）时表现合理。而对于更高分析灵敏度的方案，原始HA判读cut-off导致GCB亚型过度判读，因产生过多CD10和Bcl-6阳性病例。将cut-off调整为30%阳性细胞且2+及以上强度（I-MHAR)后，显著改善了中等及强IHC方案的准确性，而弱方案准确性明显下降。这些结果提示，原始HA判读评分方案是基于低于当今大多数临床IHC方案的分析灵敏度所开发。该证据支持既往强调病理医师判读（或评分方案）需调整至IHC方案整体分析灵敏度的研究。该研究结果同时强调，现有诊断性生物标志物重新定位为预后或预测性生物标志物时，不应未经适当验证。本案例中，诊断性生物标志物作为预测性生物标志物的重新定位，需要针对公认参考方法进行所谓的"间接临床验证"，包含50例阳性与50例阴性病例。
**IHC方案协调化的重要性与标准化控制品的作用**
尽管可通过评估IHC分类与GEP亚型之间的诊断准确性来衡量两者一致性，但由于HA判读方案中缺乏"不可分类"组，无法达到完美结果。尽管如此，该QA研究的结果优于其他报道系列，主要原因在于既往研究未尝试调整IHC方案或判读以优化性能。该研究结果为GEP基础的COO分类提供了比较而非验证，若初始结果不理想则需进行调整。该研究提供证据表明，鉴于过去20年IHC方案整体分析灵敏度的显著进步，HA的cut-off调整确有必要。当今增强的分析灵敏度可归因于改进的抗原修复、更优质的一抗、检测系统技术的提升以及实验室实践的标准化。此外，该研究中标准化控制品的使用改善了HA IHC方案的实验室间可重复性及VC中的总体结果，因若干参与者在VC检测中调整其方案以实现所有3项生物标志物的最佳分析灵敏度水平。
**改良Hans算法的临床转化路径**
该研究数据增强了对现有IHC基础DLBCL分型的信心。尽管初始加拿大TC中使用的IHC方案大体处于既往已建立数据的可接受范围，但通过改良判读/评分及VC结果提供的证据表明，目前普遍存在的HA次优PPV和NPV是可以改善的。在此过程中，必须同时考虑IHC方案的分析灵敏度与判读cut-off，以开发最优HA IHC检测，获得与GEP基础COO亚型的高度一致性。该研究还表明，额外生物标志物并非提高IHC方案诊断准确性所绝对必需，适当的间接临床 validation，充分考虑分析灵敏度及评分系统才是任何IHC检测分析阶段的关键组成部分。IHC方案的分析灵敏度可通过使用所谓的"描述性检测低限"（如iCAPCs)进行观察。该原则已被NordiQC及其他能力验证项目采纳，建议将标准化控制品用于包括CD10、Bcl-6及MUM1在内的各种IHC方案。该研究利用此方法协助加拿大范围内这3项IHC方案的协调化。此外，Boston Cell Standards目前提供用于测量各种IHC方案分析灵敏度的合成校准品，但CD10、Bcl-6及MUM1的此类校准品尚未开发，未来开发后将对方法学转移及持续监测具有重要价值。
**研究局限性与未来方向**
该研究的局限性包括：（i）依赖iCAPCs及描述性检测限而非定量检测限值，因CD10、BCL6和MUM1的合成校准品尚不可用；（ii）依赖病理医师评分而非可能更客观的基于人工智能的算法，后者目前对这些生物标志物检测尚不可用；以及（iii）无法在临床试验中进行临床验证，导致依赖使用GEP结果的间接临床验证。
**研究结论**
Hans算法的临床性能可在临床IHC实验室间得到改善并协调化。基于该研究结果，研究人员提议：若使用的IHC方案能够在CD10、Bcl-6和MUM1免疫组织化学关键检测性能控制品（iCAPCs）上产生最佳结果，则应在临床实践中实施>30%且>2+染色强度的改良Hans算法cut-off。IHC方案分析灵敏度的考量对于已发表文献与临床应用之间的可靠方法学转移至关重要。尽管采用3种不同IHC检测的HA具有高度复杂性，所有3项IHC方案均需通过使用相关参考标准（如iCAPCs等标准化控制品）来开发，以产生最佳信噪比。IHC染色切片的判读/评分cut-off需要调整并与IHC方案的分析灵敏度相一致。对于当今临床实践中普遍存在的具有中等或高分析灵敏度的IHC方案，需要采用>30%且>2+染色强度的强度改良HA判读以达到更高撒在准确性。现有诊断性IHC方案（如CD10、Bcl-6和MUM1的诊断性生物标志物）重新定位为预后或预测性生物标志物使用时，需要针对公认参考方法/金标准（本例中为GEP）验证IHC方案及判读（病理医师±图像分析）。用于诊断性生物标志物的分析灵敏度，或在某一实验室以其自身未知分析灵敏度的IHC方案开发的评分系统，当相同生物标志物用作预后或预测性生物标志物时，可能并不适用。仅应使用经适当验证的HA IHC方案，且诊断灵敏度与特异度均>90%，方可在临床试验及其他研究中用于判定HA的临床效用。
