SHP2通过促进转化生长因子-β类型I受体（TβRI）的不稳定化负向调控转化生长因子-β（TGF-β）信号通路

《Cell Communication and Signaling》：SHP2 negatively regulates TGF-β signaling by destabilizing the TGF-β type I receptor

　　

含SRC同源结构域2（SH2）的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP2），作为众多信号通路的中心节点，在包括癌症在内的多种疾病中发挥着重要作用。转化生长因子β（TGF-β）在胚胎发育和肿瘤发生过程中影响广泛的生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、分化和迁移。TGF-β以细胞背景依赖性的方式调控细胞增殖；TGF-β介导的生长抑制功能丧失是癌细胞的主要特征之一。SHP2在癌细胞和成纤维细胞中调控经典和非经典TGF-β信号通路，然而，TGF-β激活SHP2的机制以及SHP2在TGF-β介导的生长抑制中的作用尚不清楚。本研究评估了TGF-β刺激正常细胞和乳腺癌细胞后SHP2的磷酸化和激活情况。通过共免疫沉淀（co-IP）实验确定了SHP2与SRC之间的相互作用。研究人员采用药理学抑制和gRNA介导的基因敲除来评估SHP2在TGF-β信号通路中的作用，并利用RNA测序鉴定经TGF-β处理的SHP2敲除细胞中的基因表达模式。利用乳腺癌细胞进行功能研究，以验证SHP2在TGF-β介导的生长抑制中的作用。研究结果表明，TGF-β通过促进SRC对SHP2的酪氨酸磷酸化来激活SHP2。在乳腺癌细胞中，SHP2缺失通过阻碍TβRI与其负调控因子SMAD7之间的相互作用，减少了TβRI的泛素化和降解。SHP2的药理学或遗传性抑制促进了TGF-β诱导的SMAD2磷酸化和转录应答。因此，抑制SHP2显著增强了TGF-β诱导的细胞生长停滞和衰老，包括促进TGF-β诱导的细胞周期抑制因子p15在基因和蛋白水平上的表达。这些发现揭示了一种TGF-β以SRC依赖性方式激活SHP2的机制，SHP2作为负反馈机制调控TGF-β信号通路。

研究背景与问题提出

转化生长因子β（TGF-β）是一种多功能细胞因子，在胚胎发育和肿瘤发生过程中调控细胞增殖、凋亡、分化和迁移等广泛的生物学过程。TGF-β对细胞增殖的调控具有显著的细胞背景依赖性，其介导的生长抑制功能丧失是癌细胞的关键特征之一。TGF-β通过与I型和II型双特异性激酶受体——TβRI和TβRII结合来发挥其细胞效应。配体结合后，组成性激活的TβRII磷酸化TβRI近膜区的GS结构域；活化的TβRI随后通过SMAD依赖性和SMAD非依赖性机制激活下游靶点。在非经典通路中，TGF-β可激活ERK1/2、JNK和p38 MAPK、PI3K-AKT、酪氨酸激酶SRC以及NF-κB等信号分子。

SHP2是由蛋白酪氨酸磷酸酶非受体11型（PTPN11）基因编码的胞质蛋白，广泛表达于多种细胞类型。SHP2含有两个SH2结构域、一个蛋白酪氨酸磷酸酶结构域以及富含脯氨酸的C末端尾部，其中包含两个关键磷酸化位点Tyr⁵⁴²和Tyr⁵⁸⁰。既往研究表明，SHP2在TGF-β信号调控中发挥复杂作用：在肺癌细胞中，SHP2敲低部分抑制TGF-β诱导的SMAD2/3磷酸化和上皮-间充质转化（EMT）；而在膀胱癌和肺癌细胞系中，SHP2通过去磷酸化泛素连接酶SMURF2的Tyr³¹⁴和Tyr⁴³⁴来抑制TGF-β信号。此外，TGF-β还能增强成纤维细胞中SHP2的磷酸酶活性，导致JAK2抑制性磷酸化位点Tyr⁵⁷⁰的去磷酸化，从而增强JAK2/STAT3信号。然而，TGF-β激活SHP2的具体机制以及SHP2在TGF-β介导的生长抑制中的作用尚不清楚。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在阐明TGF-β调控SHP2的分子机制及其在乳腺癌中的功能意义，相关成果发表在《Cell Communication and Signaling》。

本研究主要采用了以下关键技术方法：在正常细胞和乳腺癌细胞系（包括小鼠乳腺上皮细胞NMuMG、小鼠乳腺癌细胞4T1和人类乳腺癌细胞MCF7）中进行细胞培养和处理；利用共免疫沉淀（co-IP）实验检测蛋白相互作用；通过药理学抑制（SHP2抑制剂SHP099、SHP1/2抑制剂NSC-87877、SRC抑制剂SU6656、TβRI激酶抑制剂SB505124）和gRNA介导的基因敲除技术（CRISPR-Cas12a系统敲除TβRI，慢病毒介导的gRNA敲除SHP2）进行功能获得和功能丧失研究；运用体外激酶实验和磷酸酶活性测定评估酶活性；采用RNA测序（RNA-Seq）结合基因本体（GO）分析鉴定基因表达模式；通过MTT比色法进行细胞增殖检测；利用定量RT-PCR检测基因表达；使用环己酰亚胺（CHX）追踪实验评估蛋白质半衰期；并通过共免疫沉淀检测泛素化水平和蛋白相互作用。

研究结果

TGF-β刺激诱导SHP2磷酸化

研究人员首先检测了TGF-β刺激后SHP2的磷酸化和激活情况。在NMuMG、4T1和MCF7三种细胞系中，TGF-β处理120分钟后均能诱导SHP2在Tyr⁵⁴²位点的磷酸化。为验证这一过程的受体依赖性，研究人员利用CRISPR-Cas12a技术构建了TβRI敲除的4T1细胞，发现TGF-β无法在这些细胞中诱导SHP2磷酸化，表明该过程需要TβRI的参与。值得注意的是，使用TβRI激酶抑制剂SB505124并不能阻止TGF-β诱导的SHP2 Tyr⁵⁴²磷酸化，提示该磷酸化事件不依赖于TβRI的激酶活性。通过体外磷酸酶活性测定，研究人员进一步证实TGF-β处理能够增强SHP2的酶活性。

TGF-β刺激增强SRC与SHP2的结合

鉴于TGF-β能够激活SRC激酶，而SHP2又已知与SRC存在协作关系，研究人员推测SRC可能参与介导TGF-β对SHP2的激活。通过STRING数据库分析和实验验证，研究人员证实SHP2与SRC存在相互作用。过表达野生型SRC能够诱导SHP2的酪氨酸磷酸化，而激酶失活突变体SRC（K295R, Y527F）则无此效应。体外激酶实验直接证明SRC能够磷酸化SHP2的Tyr⁵⁴²位点。功能上，SRC过表达显著增强SHP2的磷酸酶活性。在MCF7细胞中，TGF-β刺激增强了SHP2与SRC的相互作用，而SRC抑制剂SU6656则能够阻断TGF-β诱导的SHP2磷酸化。这些结果表明，TGF-β通过促进SRC与SHP2的结合，进而由SRC磷酸化并激活SHP2。

SHP2与TβRI相互作用并调控其酪氨酸磷酸化

作为蛋白酪氨酸磷酸酶，SHP2可能通过去磷酸化TβRI来调控信号转导。体外实验表明，纯化的SHP2能够显著降低SRC诱导的TβRI酪氨酸磷酸化水平。在细胞水平，过表达野生型SHP2能够显著降低TGF-β诱导的TβRI酪氨酸磷酸化，而酶活性缺陷突变体SHP2（C495S）则无此效应。TGF-β刺激增强了野生型SHP2与TβRI的相互作用，但该增强效应在SHP2（C495S）突变体中消失，提示SHP2的酶活性促进了其与TβRI的TGF-β诱导性相互作用。SHP2特异性抑制剂SHP099也能 abolish（消除）TGF-β诱导的SHP2-TβRI相互作用，并伴随TβRI酪氨酸磷酸化水平的升高。这些发现证实SHP2与TβRI相互作用，并负向调控其酪氨酸磷酸化。

SHP2抑制TGF-β信号通路

为探究SHP2在TGF-β信号中的功能角色，研究人员利用SMAD响应性CAGA-荧光素酶报告基因检测系统进行了评估。结果显示，无论是使用NSC-87877还是SHP099抑制SHP2，均能显著增强TGF-β诱导的CAGA-荧光素酶活性。在SHP2敲除的MCF7细胞中，TGF-β诱导的CAGA-荧光素酶报告基因活性和SMAD2磷酸化水平均显著增强。相反，过表达野生型SHP2能够减弱TGF-β诱导的CAGA-荧光素酶活性，而酶活性失活突变体SHP2（C459S）则无此抑制作用。这些结果共同强调了SHP2在调控TGF-β信号中的负反馈作用。

抑制SHP2增强TGF-β的生长抑制效应

研究人员进一步通过RNA-Seq分析探索了SHP2在TGF-β诱导的生理反应中的作用。在野生型MCF7细胞中，TGF-β处理主要富集与"上皮细胞迁移"相关的基因本体生物学过程；而在SHP2敲除细胞中，TGF-β处理则转向富集"上皮细胞增殖调控"等过程，提示SHP2敲除影响了TGF-β对细胞增殖的调控效应。功能实验证实 indeed，SHP2的药理学抑制（SHP099）能够增强TGF-β对NMuMG、4T1和MCF7细胞的生长抑制作用，而SHP2的基因敲除也产生类似效果。重要的是，在TβRI敲除的4T1细胞中，SHP099处理虽能降低基础细胞生长，但无法增强TGF-β的效应，表明SHP2抑制对TGF-β诱导生长抑制的增强作用依赖于TβRI。

抑制SHP2增强TGF-β诱导的细胞衰老

为深入阐明SHP2影响TGF-β诱导生长抑制的机制，研究人员通过RNA-Seq比较了野生型和SHP2敲除MCF7细胞中TGF-β诱导的差异表达基因。结果显示，SERPINE1在TGF-β刺激的SHP2敲除细胞中显著上调，而在野生型细胞中则无明显变化。SERPINE1是衰老细胞的标志物，其产物与衰老相关分泌表型（SASP）因子的分泌相关。SA-β-半乳糖苷酶染色实验证实，野生型MCF7细胞中TGF-β单独处理不能显著诱导衰老，但SHP2敲除本身即可诱导细胞衰老，并显著增强细胞对TGF-β诱导衰老的敏感性。

CDKN2B是细胞衰老的成熟转录标志物，其编码产物p15能够促进TGF-β诱导的生长停滞。研究人员发现，SHP2抑制剂SHP099处理或SHP2基因敲除均能显著增强TGF-β诱导的CDKN2B mRNA上调，并进一步增强TGF-β诱导的p15蛋白水平升高。这些观察结果表明，SHP2抑制通过增强TGF-β诱导的CDKN2B/p15上调，正向调控了TGF-β介导的生长停滞和细胞衰老。

抑制SRC促进TGF-β诱导的衰老和生长抑制

基于SRC磷酸化并激活SHP2的发现，研究人员进一步探索了SRC在TGF-β信号中的作用。在MCF7细胞中，SRC抑制剂SU6656处理显著增强了TGF-β诱导的CDKN2B转录和p15蛋白表达，并促进TGF-β诱导的细胞衰老和生长抑制。这些结果提示，SRC抑制通过阻止SHP2的激活，使细胞对TGF-β诱导的衰老和生长抑制更加敏感。

SHP2抑制增加TβRI的稳定性

为阐明SHP2调控TGF-β信号的分子机制，研究人员检测了SHP2敲除后TGF-β信号关键组分的蛋白水平。结果显示，SHP2敲除特异性地增加了TβRI的蛋白水平，但TGFBRI mRNA水平无显著变化，提示SHP2影响TβRI的蛋白稳定性。环己酰亚胺（CHX）追逐实验证实，SHP2敲除显著延长了TβRI的蛋白半衰期，同时降低了TβRI的整体泛素化水平。

SMAD7是TGF-β信号的经典负调控因子，通过招募E3泛素连接酶SMURF2促进TβRI的泛素化和蛋白酶体降解。研究人员推测SHP2可能通过影响SMAD7-TβRI相互作用来调控受体稳定性。共免疫沉淀实验证实，SHP2敲除显著降低了TβRI与SMAD7的相互作用。相反，过表达SHP2则增强了TβRI与SMAD7的相互作用，以及TβRI与SMURF2的相互作用。这些结果表明，SHP2通过促进SMAD7与TβRI的结合，进而招募SMURF2介导TβRI的泛素化降解，从而负向调控TGF-β信号。

基于上述发现，研究人员提出了一个工作模型：TGF-β激活SRC，SRC继而磷酸化并激活SHP2；活化的SHP2与TβRI相互作用，通过促进受体降解来减弱TGF-β信号，从而形成负反馈调控环路。

讨论与结论总结

本研究揭示了TGF-β信号通路中一个此前未被充分认识的SRC-SHP2-TβRI负反馈调控轴。研究人员证实，TGF-β以不依赖于TβRI激酶活性的方式，通过SRC依赖性的SHP2 Tyr⁵⁴²磷酸化来激活SHP2。这一发现拓展了对TGF-β信号精细调控机制的理解，将SRC的非经典信号功能与SHP2的磷酸酶活性进行了功能连接。

在分子机制层面，研究阐明了SHP2通过促进TβRI与SMAD7的相互作用，进而增强SMURF2介导的TβRI泛素化降解，从而负向调控TGF-β信号。这一机制将SHP2的功能与SMAD7-SMURF2这一经典的TGF-β负调控模块相联系，为理解TGF-β信号的时空调控提供了新视角。值得注意的是，SRC在TGF-β信号中具有双重角色：一方面，SRC直接磷酸化TβRI促进非经典信号如细胞迁移；另一方面，SRC通过激活SHP2限制经典SMAD信号的强度和持续时间。

在功能层面，研究证实了SHP2抑制能够显著增强TGF-β对乳腺癌细胞的生长抑制和促衰老效应，这为乳腺癌治疗提供了潜在的策略依据。特别是，SHP2特异性抑制剂SHP099能够增强细胞对TGF-β生长抑制信号的敏感性，而TGF-β在肿瘤早期具有抑癌作用，这一发现具有重要的转化医学意义。然而，研究人员也认识到TGF-β在肿瘤进展后期的促癌作用，因此SHP2抑制剂在临床中的应用需要谨慎评估肿瘤阶段和细胞背景。

研究结论部分指出，这些观察结果为TGF-β信号的反馈控制机制提供了新见解，即通过SRC介导的SHP2磷酸化导致TβRI不稳定化。研究人员进一步证实，SHP2抑制通过阻碍SMAD7与TβRI的相互作用、减少TβRI降解，从而正向调控TGF-β信号，增强细胞生长停滞和衰老相关基因（如SERPINE1和CDKN2B）的诱导表达。本研究的局限性在于所提出的SRC-SHP2-TβRI调控轴主要在体外培养的细胞和乳腺上皮细胞模型中进行表征，未来在适当的体内肿瘤模型中验证该通路的重要性将具有重要意义。