GCN5与TADA2B在DNA修复过程中对XRCC1功能的组成性调控以维持细胞存活

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：GCN5 and TADA2B constitutively regulate XRCC1 function during DNA repair to maintain cell survival

　　

XRCC1通过蛋白质-蛋白质相互作用协调碱基切除修复（BER)和单链断裂修复(SSBR)，其功能破坏可导致包括常染色体隐性脊髓小脑共济失调26型(SCAR26)在内的神经系统疾病ngoing研究疾病。尽管PARP1介导的招募机制已明确建立，但组成性调控机制此前尚不清楚。本研究中，研究人员鉴定出SAGA（Spt-Ada-Gcn5乙酰转移酶）组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合物的组分GCN5和TADA2B为XRCC1的新型结合伴侣，为修复定位提供组成性调控。这些蛋白通过不同的BRCT（BRCA1 C末端）结构域与XRCC1结合——GCN5结合BRCT I，TADA2B结合BRCT II——此过程独立于DNA损伤或GCN5的乙酰转移酶活性。任一蛋白的耗竭均会损害DNA修复效率、使细胞对基因毒性应激敏感并增加细胞死亡，证明其在细胞存活中的关键作用。意外的是，GCN5或TADA2B的缺乏可挽救BRCT II缺失突变体的焦点滞留缺陷，揭示了组成性相互作用如何优化正常XRCC1功能，却在XRCC1结构受损时变得适得其反。此外，与SCAR26相关的BRCT II点突变破坏TADA2B结合，但矛盾的是，这种 normally beneficial（通常有益的）相互作用在突变背景下转变为抑制性作用。研究人员的发现确立了一种"随时待命"(ready-for-action)模型，即修复复合物在DNA损伤发生前即预先组织好相关机器，揭示了组成性调控如何决定细胞对DNA损伤的反应。

神经系统是人体最复杂的器官系统，需要精确的调控机制，包括DNA损伤应答(DDR)和修复通路。多项DNA修复缺陷动物模型研究表明，内源性DNA损伤在脑发育过程中自然发生，尽管其确切性质尚不完全清楚。然而，DNA修复受损显然会导致神经发育异常和严重神经系统疾病。共济失调毛细血管扩张症(A-T)是DNA修复与神经功能之间关键联系的经典范例，患者表现出进行性小脑共济失调及多种非神经症状，由ATM（共济失调毛细血管扩张症突变）基因突变引起，该蛋白激酶在DNA链断裂时磷酸化包括H2AX、KAP1、CHK2和p53在内的众多底物以协调修复、DDR、细胞周期调控和凋亡。尽管小脑功能障碍与DNA修复缺陷的关联已明确，但其潜在分子机制仍不清楚。与DNA修复缺陷相关的、具有神经系统表型（特别是小脑共济失调）的人类遗传性疾病日益增多，包括SCAN1（TDP1突变）、AOA1（APTX突变）和AOA4（PNKP突变）以及MCSZ（PNKP突变），这些疾病均由BER或SSBR机制缺陷导致。值得注意的是，这些BER/SSBR蛋白通过XRCC1依赖的蛋白质-蛋白质相互作用被招募至DNA损伤位点。XRCC1作为关键支架蛋白，通过在损伤位点促进多种修复蛋白的组装来协调BER和SSBR。XRCC1的临床重要性因SCAR26的鉴定而凸显，该病由XRCC1复合杂合突变引起，特征为成人发病的脊髓小脑共济失调、进行性小脑萎缩和轴突神经病变。

然而，Xrcc1缺陷动物模型的比较分析出现了一个令人困惑的差异。Xrcc1条件性敲除小鼠表现出自发性癫痫、轻度共济失调和显著的小脑中间神经元丢失，这些神经元因细胞周期停滞而死亡。有趣的是，已建立的XRCC1结合伴侣（包括Polb、Lig3、Tdp1、Pnkp和Aptx）的单独敲除模型均未重现这些确切的小脑表型，每个动物模型仅显示与Xrcc1敲除表型部分重叠的 distinct neurological manifestations（不同神经表现），提示可能存在额外的、尚未发现的XRCC1相互作用蛋白负责Xrcc1 null动物中观察到的特异性小脑表型。

这一表型差异促使研究人员系统搜索新型XRCC1结合伴侣。研究人员鉴定出TADA2B（转录适配器2B）和GCN5（General Control of Non-depressible 5/KAT2A——赖氨酸乙酰转移酶2A）为此前未知的XRCC1结合蛋白。TADA2B和GCN5是SAGA复合物HAT模块的组分，TADA2B-GCN5相互作用是GCN5全酶活性所必需的。此外，TADA2B在胚胎干细胞的多能性、存活、生长和谱系特异性中发挥重要作用。虽然拟南芥中的ADA2b定位于DNA双链断裂(DSB)位点并影响DNA修复，但TADA2B在哺乳动物DNA修复中的作用此前未被探索。另一方面，GCN5通过组蛋白乙酰化调控基因表达，也乙酰化包括BRCA1和PARP2在内的DNA修复蛋白以增强修复功能。UV损伤后，GCN5介导的RPA1乙酰化通过与XPA的相互作用增强核苷酸切除修复(NER)。Gcn5缺失导致小鼠早期胚胎致死，而乙酰转移酶结构域突变导致包括颅神经管闭合缺陷和露脑在内的神经系统发育缺陷。相比之下，Tada2b小鼠模型尚未被生成和研究。

研究人员首先验证GST-XRCC1 pulldown实验的可行性，使用小鼠胚胎脑裂解液，成功检测到已知XRCC1结合伴侣LIG3、PNKP和POLB。随后使用成年Xrcc1WT和Xrcc1Nes-Cre小鼠小脑裂解液进行该实验，质谱分析鉴定出多个已知XRCC1相互作用蛋白，以及新的多肽条带TADA2B。该蛋白作为SAGA复合物HAT模块的一部分与GCN5结合。TADA2B在小脑中的表达高于大脑皮层，与XRCC1和LIG3类似，而GCN5则呈现相反的脑区分布模式，且Xrcc1缺失不影响这些蛋白的表达。

为机制性表征这些相互作用并评估其与DNA修复的相关性，研究人员转向人类蛋白进行详细分析。通过GST pulldown实验，使用核酸酶处理的HEK293T细胞裂解液，意外发现XRCC1、TADA2B和GCN5三者相互结合。为在细胞内验证这些相互作用，研究人员表达SFB标签蛋白，链霉亲和素bead pulldown实验证实内源性XRCC1、TADA2B或GCN5均与SFB标签对应蛋白结合。考虑到GCN5和TADA2B已建立直接相互作用，研究人员进一步探讨任一蛋白是否可能通过另一蛋白间接结合XRCC1。在HeLa细胞中分别敲低GCN5或TADA2B后进行GST-pulldown实验，发现GCN5敲低也降低TADA2B表达，MG132处理可恢复TADA2B水平，提示GCN5结合稳定TADA2B蛋白水平，类似于XRCC1-LIG3关系。GCN5敲低后，GST-XRCC1无法 pulldown GCN5或TADA2B，但GST-GCN5和GST-TADA2B在GCN5敲低细胞裂解液中仍能 pull-down内源性XRCC1；TADA2B敲低样品中也检测到XRCC1-GCN5直接结合。使用昆虫细胞表达的重组蛋白进行体外结合实验，证实TADA2B-XRCC1、GCN5-XRCC1和GCN5-TADA2B之间存在直接蛋白质-蛋白质相互作用，这些相互作用不需要其他细胞组分。

研究人员进一步表征这三种蛋白中的特异性结合结构域。基于既往报道，研究人员克隆了每种蛋白的多个截短变体，并构建了XRCC1 BRCT结构域缺失突变体XRCC1ΔB1D（缺失BRCT I）和XRCC1ΔB2D（缺失BRCT II）。链霉亲和素pulldown实验表明，GCN5可结合XRCC1 NTD和BRCT I结构域，而TADA2B与XRCC1 NTD及两个BRCT结构域均相互作用。为验证这些结构域特异性相互作用，使用SFB-XRCC1ΔB1D或SFB-XRCC1ΔB2D进行pulldown，证实XRCC1 BRCT I结构域是GCN5的主要结合位点，而BRCC1 BRCT II结构域特异性结合TADA2B。互作结构域的反向映射显示，XRCC1主要与GCN5的ACT（HAT功能结构域）和TADA2B的CTL相互作用。AlphaFold和ColabFold计算建模支持这些发现，预测GCN5靠近BRCT I而TADA2B跨越两个BRCT结构域。

通常，XRCC1结合伴侣在DNA损伤后显示与XRCC1的增强相互作用。研究人员使用四种不同DNA损伤试剂（MMS、CPT、Phleo和H₂O₂）测试GCN5或TADA2B与XRCC1的结合是否受DNA损伤调控，结果发现这些药物处理均未影响XRCC1、GCN5和TADA2B之间的蛋白相互作用，揭示XRCC1与GCN5和TADAasper的组成性结合独立于DNA损伤状态。

为研究GCN5和TADA2B在DNA修复和应答中的作用，研究人员分析DNA损伤下的功能获得和功能丧失效应。克隆形成实验显示，XRCC1、GCN5或TADA2B单独敲低均减缓整体增殖；基因敲低细胞对DNA损伤剂呈剂量依赖性增敏。SRB实验同样显示所有三种敲低细胞系相对于对照组的存活显著降低。细胞周期分析表明，暴露于DNA损伤试剂后所有细胞均显示G2/M期阻滞，细胞周期检查点反应保持完整。尽管细胞周期进程相似，所有敲低细胞在长期培养中增殖降低，提示细胞走向替代命运：细胞衰老。β-半乳糖苷酶染色证实XRCC1、GCN5或TADA2B缺乏导致长期培养条件下的细胞衰老。Annexin V/PI染色及FACS分析显示，暴露于各种DNA损伤剂后，所有三种敲低细胞系均表现出早期和晚期凋亡增加，BAX上调。

研究人员进一步研究DNA损伤诱导后的早期信号事件和损伤修复效率。所有三种敲低细胞系显示与对照相当的DDR动力学，包括ATM磷酸化及其激酶底物磷酸化以及CHK1磷酸化。然而，去除DNA损伤剂3小时后，所有三种敲低细胞系维持升高的γ-H2AX水平，提示DNA修复受损。免疫化学分析显示，去除DNA损伤试剂24小时内，所有三种敲低细胞系未能解析γ-H2AX焦点，证明存在持续的未修复DNA损伤。使用pHPRT-DRGFP（同源重组修复报告基因）和pimEJ5GFP（非同源末端连接报告基因）的DSB修复能力检测显示，所有三种敲低细胞系修复效率受损。彗星实验直接测量DNA损伤修复能力，所有三种敲低U2OS细胞系显示显著增加的彗星尾矩，与DR-GFP/EJ5-GFP结果一致。

研究人员接下来检测GCN5和TADA2B对XRCC1在DNA损伤位点行为的影响。使用微照射(micro-IR)技术实时追踪蛋白向DNA损伤位点的移动。虽然GCN5和TADA2B实时招募不可检测，但免疫化学显示两种蛋白均定位于DNA损伤位点。XRCC1在GCN5或TADA2B敲低后聚焦积累受损，表现为荧光强度降低和损伤位点处荧光线条变薄。BRCT I结构域缺失完全阻止XRCC1招募，而BRCT II结构域缺失导致异常招募，表现为微照射位点强度降低。这些招募缺陷在GCN5或TADA2B敲低细胞中持续存在。GCN5抑制剂处理未改变XRCC1或XRCC1 BRCT结构域突变体的招募动力学。引人注目的是，XRCC1ΔB2D显示招募受损和 indeed focal retention（焦点滞留）缺陷，其积累随时间逐渐扩散，这些缺陷通过GCN5或TADA2B敲低得到挽救，但GCN5抑制剂处理不能挽救。

研究人员构建XRCC1敲除U2OS细胞系，发现XRCC1敲除不改变GCN5和TADA2B表达。在XRCC1敲除U2OS细胞中，GCN5和TADA2B均未被招募至微照射位点，而在WT细胞中两种蛋白均积累于DNA损伤位点；XRCC1重组恢复GCN5和TADA2B向DNA损伤位点的招募，证明GCN5和TADA2B结合XRCC1对XRCC1的适当聚焦招募至关重要，且GCN5和TADA2B的招募是XRCC1依赖的。

为使用临床相关变体验证这一调控模型，研究人员将三种SCAR26相关点突变（c.1196 A>G/Gln399Arg位于BRCT I，c.1293 G>C/Lys431Asn位于CTL，c.1738 C>T/Arg580Trp位于BRCT II）引入XRCC1构建体。SFB pulldown实验显示A1196G和G1293C突变体保留与GCN5、TADA2B和LIG3的结合；相比之下，C1738T结合GCN5和LIG3，但丧失TADA2B相互作用，这一结合模式模拟XRCC1ΔB2D。实时成像显示所有三种突变体招募与WT XRCC1相当，但C1738T未能在DNA损伤位点维持。GCN5或TADA2B敲低时，C1738T招募显著降低， reminiscent of XRCC1ΔB2D的招募行为。此外，C1738T显示DNA损伤位点焦点滞留缺陷，尽管较XRCC1ΔB2D轻微。这种进行性扩散、非聚焦的C1738T滞留通过GCN5或TADA2B敲低得到纠正，遵循与XRCC1ΔB2D相同的模式。这些数据提示，当TADA2B无法结合突变BRCT II结构域时，GCN5结合可能变得有害，可能通过将TADA2B束缚于非生产性构型来阻碍XRCC1在DNA损伤位点的焦点滞留。

尽管GCN5抑制剂处理不影响XRCC1招募动力学，研究人员进一步研究XRCC1是否为GCN5 HAT酶活性的底物。变性方案去除XRCC1相关蛋白后进行链霉亲和素pulldown和抗乙酰赖氨酸抗体检测，结果显示DNA损伤后XRCC1乙酰化无显著诱导，GCN5抑制剂处理或siRNA介导的GCN5敲低均未改变XRCC1乙酰化状态。研究人员生成两种充分表征的GCN5 HAT-dead突变体（E575Q和Y621A/F622A），这些HAT-dead GCN5突变体与WT GCN5显示与XRCC1相当的结合，尽管TADA2B与HAT-dead GCN5的结合较WT GCN5降低。GCN5抑制剂处理不影响XRCC1-GCN5结合。两种HAT-dead突变体在DNA损伤后的招募行为与WT GCN5相似：均被招募至DNA损伤位点，但在XRCC1 null细胞中此招募缺失。GCN5敲低细胞中XRCC1招募受损，而WT或HAT-dead GCN5重组均恢复正常的XRCC1招募，证明HAT活性对招募是可有可无的。

总体而言，研究结果确立GCN5和TADA2B作为新型调控因子，可能通过HAT非依赖机制发挥双重效应：在正常情况下优化XRCC1功能，而在XRCC1结构受损时变得适得其反。

在讨论部分，研究人员指出DNA碱基损伤是细胞中最普遍的基因组损伤，每天每个细胞发生数千次。此修复中，BER/SSBR因子的招募依赖于XRCC1，其通过广泛的蛋白质-蛋白质相互作用协调修复。自1990年代建立PARP1-XRCC1通过XRCC1 BRCT I结构域的相互作用以来，XRCC1向DNA损伤位点的招募被理解为依赖PARP1激活和随后的PARylation，如本研究中XRCC1ΔB1D无法被招募至DNA损伤位点所证实。然而，这种以PARP1为中心的模型不足以解释XRCC1招募和效力的精确时空控制，特别是控制焦点滞留和修复位点维持的机制。

研究人员报告GCN5和TADA2B——SAGA复合物HAT模块的组分——作为新型XRCC1相互作用蛋白的发现，扩展了对修复调控的理解。这两种蛋白组成性结合XRCC1，无论DNA损伤是否发生，且DNA损伤不进一步增强这些蛋白相互作用。关键发现是，GCN5和TADA2B通过完全独立于其在SAGA复合物中经典HAT活性的机制在BER/SSBR中发挥功能。尽管GCN5具有充分确立的乙酰转移酶功能，XRCC1不被GCN5乙酰化，且药理学抑制GCN5 HAT活性不损害XRCC1招募动力学。相反，蛋白质-蛋白质相互作用驱动其在DNA修复中的调控功能，这些相互作用即使在产生GCN5 HAT-dead形式的点突变体中仍维持。这种HAT非依赖的支架功能可能使"随时待命"调控机制成为可能，即修复机器组成性预先组织，而非在DNA损伤诱导后从头组装。

GCN5通常靶向KK、KXK和EK氨基酸基序内的赖氨酸(K)残基。综合序列分析显示XRCC1内无排他性GCN5乙酰化位点；数据库搜索识别潜在靶赖氨酸(K260、K281和K419)也被其他乙酰转移酶（如PCAF、CBP/p300和TIP60）靶向。这一发现证明SAGA复合物组分可采用双重功能角色：经典的HAT依赖转录调控和DNA修复协调中的新型HAT非依赖结构功能。值得注意的是，SIRT1介导的XRCC1去乙酰化防止蛋白酶体降解并稳定化疗耐药肺癌中的XRCC1，但负责的乙酰转移酶尚待鉴定。此外，PAR结合筛选鉴定XRCC1而非GCN5或TADA2B为PAR结合蛋白。然而，GCN5经历PARP1介导的PARylation，对其招募至DSB位点至关重要，在该位点其乙酰化和巴豆酰化DNA-PKcs以促进DSBR。此外，GCN5与E2F1在NER中协作，但TADA2B在这些修复背景中的参与尚未确定。

当前研究中，研究人员证明GCN5和TADA2B作为BER/SSBR机器的组分发挥功能。GCN5（包括GCN5 HAT-dead突变体）和TADA2B在XRCC1缺陷细胞中不被招募至DNA损伤位点，表明XRCC1对其损伤位点定位起关键作用，且这三种蛋白向DNA损伤位点的招募是相互依赖的。此外，GCN5或TADA2B的耗竭导致DNA修复效率受损和细胞死亡增加，证明其在哺乳动物BER/SSBR中的功能重要性。对HR和NHEJ的影响可能反映多种机制：未修复SSB可通过复制叉崩溃或反向链近距离SSB被识别为功能性DSB而转化为DSB，可能压倒HR能力；XRCC1缺陷可导致LIG3不稳定并可能破坏替代NHEJ所需的MRN复合物相互作用，而非正常的PARP1捕获可进一步损害两种通路。除这些XRCC1非依赖机制外，GCN5和TADA2B可能在基因组稳定性维持中有更广泛作用，有待进一步研究。虽然数据确立XRCC1不是直接GCN5底物，但不能排除GCN5在XRCC1介导的招募后乙酰化其他BER/SSBR因子的可能性。据报道p300或CBP对BER/SSBR因子的乙酰化有助于修复效率的精细调控，但GCN5在此过程中的参与尚待探索。此外，GCN5可能通过其在损伤位点组蛋白修饰的成熟作用促进染色质松弛来促进修复。

当这些蛋白相互作用被破坏时，XRCC1招募效率显著降低，证明XRCC1、GCN5和TADA2B之间的组成性蛋白相互作用对XRCC1招募的适当快速精细调控是必需的。考虑到GCN5的功能，这些组成性相互作用可能促进XRCC1定位以便在损伤检测后有效招募。结构域分析揭示两个BRCT结构域发挥 essential but distinct roles（必要但不同的作用）。BRCT I结构域作为GCN5的主要结合位点，对通过PARP1结合的初始招募至关重要。相比之下，结合TADA2B的BRCT II结构域对损伤位点的集中焦点滞留是必需的。XRCC1ΔB2D显示受损招募和损伤位点进行性扩散，提示两个BRCT结构域的不同功能作用：BRCT I介导招募本身，而BRCT II确保持集中滞留。

引人注目的是，GCN5或TADA2B的耗竭挽救XRCC1ΔB2D的焦点滞留缺陷和扩散积累，尽管招募动力学无改善。ΔB2D突变体保留结合GCN5的BRCT I结构域，GCN5进而系留TADA2B。这种蛋白构型可能阻止XRCC1ΔB2D突变体达到最佳DNA接近。通过GCN5/TADA2B耗竭去除这些蛋白约束改善了XRCC1ΔB2D的焦点滞留。这些发现揭示XRCC1与GCN5/TADA2B的相互作用在双重调控控制下运作。正常情况下，GCN5和TADA2B对XRCC1的及时招募和精细调控焦点积累至关重要。然而，当XRCC1受损时——特别是通过BRCT II结构域突变——这些相同蛋白相互作用成为阻碍焦点XRCC1积累的抑制性约束。这代表一种动态控制机制，调控网络根据XRCC1的结构完整性调整其功能。为验证这一双重调控机制，研究人员检查了SCAR26相关XRCC1突变体。特别是BRCT II突变体(c.1738 C>T/p.Arg580Trp)不能结合TADA2B，行为类似XRCC1ΔB2D突变体，显示DNA损伤位点缺陷和进行性扩散积累。重要的是，这一滞留缺陷被GCN5或TADA2B耗竭挽救，而招募动力学恶化——模拟ΔB2D挽救模式，强化GCN5/TADA2B在精细调控XRCC1高效聚焦招募中的关键作用。XRCC1ΔB2D和p.Arg580Trp的相似行为证明，破坏的XRCC1-TADA2B相互作用产生不利的蛋白构型，阻碍焦点积累和滞留，而消除GCN5或TADA2B以牺牲快速招募动力学为代价恢复滞留。这些发现揭示了一种新型"组成性约束"机制。虽然蛋白-蛋白相互作用在突变时经常从有益转变为有害，但观察到的具体调控模式——两种蛋白组成性结合第三种蛋白的不同结构域，且这些结合伴侣的去除挽救突变体功能——代表了一种此前未被识别的范式。这一机制根本不同于已知的竞争性结合或变构抑制等范式。这些发现还为未来患者发现的潜在SCAR26病理生理学提供了分子见解。

综上所述，研究人员证明GCN5/TADA2B复合物作为XRCC1招募至DNA损伤位点的新型精细调控因子，控制招募动力学和焦点滞留。这些蛋白之间的组成性结合建立了一种准备性调控网络，在损伤检测时将XRCC1定位以待及时反应。此外，研究结果揭示了这种调控机制的双重性质。虽然GCN5/TADA2B相互作用优化WT XRCC1功能，但当XRCC1结构受损时它们变得适得其反。特别是，BRCT II结构域突变将有益的调控相互作用转化为阻碍焦点XRCC1积累的抑制性约束。这种情境依赖性调控解释了同一蛋白网络如何增强正常修复而在疾病状态下加剧功能障碍。