牛源ATP合酶(syn. F1Fo-ATP synthase/Complex V)的平面二聚体形式

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：A planar dimer of bovine ATP synthase

　　

哺乳动物线粒体ATP合酶(ATP synthase/F1Fo-ATP synthase)通常以V形二聚体行列排布，诱导显著的膜曲率，对线粒体内膜(Inner Mitochondrial Membrane, IMM)嵴(cristae)的形成至关重要。研究人员采用温和的无柱纯化结合单颗粒冷冻电镜(single-particle cryo-electron microscopy, cryo-EM)，鉴定出一种此前未被识别的牛源ATP合酶平面二聚体(planar dimeric form)，其引起的膜弯曲极小。该平面二聚体的结构特征为两个ATP合酶复合物以反向平行排列，由伸直构象的抑制因子1(Inhibitory factor 1, IF1)连接，与四聚体中观察到的IF1扭结(kinked)构象形成鲜明对比。分子动力学模拟(Molecular dynamics, MD simulations)证实IF1在伸直与扭结构象间的转换无明显能垒。平面二聚体的外周 stalk(peripheral stalk, PS)相对于相邻的α亚基呈特异方位。这些结构差异表明平面ATP合酶二聚体具有特化功能及独特细胞定位，为线粒体ATP合酶群体的功能分工(division of labor)提供了结构依据。

牛源线粒体F₁F_o-ATP合酶平面二聚体结构的发现与功能意义——论文解读

本文发表于《Cell Death and Differentiation》，报道了牛心肌线粒体ATP合酶(ATP synthase/F₁F_o-ATP synthase, Complex V)中存在一种此前未被鉴定的平面二聚体(planar dimer)寡聚形式。传统观点认为哺乳动物线粒体内膜上的ATP合酶组装为V形二聚体并进一步形成高阶寡聚物，诱导~90°膜弯曲以塑造嵴脊(cristae ridge)；然而活细胞成像显示线粒体内存在不同迁移率的ATP合酶亚群，部分可水解ATP并定位于近平面的内边界膜(Inner Boundary Membrane, IBM)，暗示可能存在不同于经典V形二聚体的结构形式。研究人员采用温和的无柱大规模纯化策略结合单颗粒冷冻电镜(cryo-EM)及分子动力学模拟(MD)，从牛心肌线粒体中同时获得经典的IF₁结合四聚体(~7.2 ?)和新发现的IF₁结合平面二聚体(~5.0 ?)，证明线粒体ATP合酶存在膜曲率和结构各异的寡聚形式，提出其功能分区(division of labor)假说。

主要关键技术方法

研究人员以新鲜牛心肌组织为样本来源，建立无色谱柱、含糖基薯蓣皂苷(glyco-diosgenin, GDN)的温和纯化流程，经蔗糖密度梯度离心分离IF₁稳定结合的寡聚ATP合酶；采用单颗粒冷冻电镜(cryo-EM)进行数据收集与三维重构(RELION/CryoSPARC软件处理)，分别解析平面二聚体(5.0 ?)与四聚体(7.2 ?)及单体(至2.3 ? F₁域)结构；构建对称牛源IF₁二聚体模型进行500 ns全原子分子动力学(MD)模拟以分析IF₁构象能垒；辅以Clear Native PAGE(CN-PAGE)、ATP水解酶活性检测及Western blot验证寡聚体稳定性与IF₁结合情况。

Isolation and stability of oligomeric ATP synthase

研究人员通过无柱GDN纯化从牛心肌线粒体内膜获得毫克级IF₁稳定结合的寡聚ATP合酶，CN-PAGE及活性测定证实其在高盐、PEG沉淀及储存过程中不发生单体化或活性升高。cryo-EM图像分类识别出两种寡聚形式：IF₁结合的四聚体(7.2 ?)及IF₁结合的平面二聚体(5.0 ?)。

IF1-bound tetramer of bovine ATP synthase

研究人员解析的牛源ATP合酶四聚体由两个V形二聚体经两个IF₁二聚体侧向交联而成，具C2对称性，相邻F₁域旋转状态分别为state 1与state 3，膜嵌合F_o域亚基(含DAPIT、g、e亚基)参与V形二聚体间相互作用，膜弯曲凸面构型与猪源四聚体一致，确认为经典高阶寡聚形式。

IF1-bound planar dimer of bovine ATP synthase

研究人员发现平面二聚体由两个ATP合酶单体以反向平行侧靠侧排列，由单一伸直(而非扭结)构象的IF₁二聚体桥接F₁域，两单体外周stalk(PS)分居IF₁两侧(与纤毛虫III型ATP合酶二聚体类似)；两单体均处于state 3旋转态，密度显示DAPIT存在而6.8PL亚基密度缺失。

Membrane bending architecture of oligomeric bovine F-ATP synthase

通过c-ring相对夹角评估膜弯曲：平面二聚体c-ring最大夹角约35°，接近单体本征弯曲(~45°)但远低于V形二聚体(~90°)及四聚体(~115°)，表明平面二聚体对膜施加极小弯曲能，适于嵌入近平面IMM区域(如IBM或平坦嵴区)。

Conformations of IF1

研究人员观察到平面二聚体中IF₁呈伸直构象，而四聚体中IF₁呈N端扭结(~56°弯折)；MD模拟显示IF₁二聚体N端相对C端二聚化域的弯折角θ无明显自由能垒(<0.6 kcal/mol ≈ kT)，直/弯构象可热涨落互变，不需额外能量输入；L MNG解聚获得的单体F₁-IF₁复合物2.3 ?图显示IF₁N端抑制区与β-Tyr385、γ亚基及自身Arg16-Gln27形成特征相互作用。

Proximity of PS and α_PS

平面二聚体中外周stalk亚基d与α_PS(结合PS的α亚基)C端结构域间隙>15 ?，明显分离；单体及四聚体中state 3原型间隙约5–8 ?，state 1原型间隙约18 ?。表明平面二聚体具保守PS-α_PS附着缺失的特征性构象。

讨论(DISCUSSION)总结

研究人员确认所获IF₁结合四聚体与经典V形二聚体行列相符，而新发现的平面二聚体非纯化 artefact——全程未见单体化、IF₁脱落或外源ATP加入，IF₁应在线粒体去极化前已结合稳定预存寡聚架构。平面二聚体弱膜弯曲、PS-α_PS分离及6.8PL缺失区别于V形二聚体(依赖6.8PL及心磷脂cardiolipin, CL)诱导膜弯曲)，推测其定位于IBM或平坦嵴，代表具高迁移性、可能行使ATP水解驱动质子泵功能的ATP合酶亚群，在病理去极化或嵴扁平化时比例可能增加。IF₁可同等稳定平面与V形寡聚形式，直/弯构象转换无障碍。研究证明哺乳动物线粒体共存功能与结构分化的ATP合酶寡聚形式，支持内膜曲率驱动的空间与功能分工(division of labor)模型。