《Human Genetics》：Long-read genome sequencing resolves a de novo complex 18q12.1q21.2 triplication causing partial tetrasomy and reveals its underlying mechanism
编辑推荐：
染色体三倍重复（triplication）是一种罕见的结构变异，常与复杂表型相关。研究人员报道了对一例超声异常胎儿中新发18q12.1q21.2染色体内三倍重复的分子特征鉴定。常规核型分析和微阵列比较基因组杂交（array-CGH）揭示了部分四倍体及一个延伸至
染色体三倍重复（triplication）是一种罕见的结构变异，常与复杂表型相关。研究人员报道了对一例超声异常胎儿中新发18q12.1q21.2染色体内三倍重复的分子特征鉴定。常规核型分析和微阵列比较基因组杂交（array-CGH）揭示了部分四倍体及一个延伸至端粒的26 Mb杂合性缺失（LOH）区域。长读长测序（LRS）鉴定了断裂点连接序列，揭示了直接-反向-直接的三倍重复结构。断裂点分析提示该重排通过姐妹染色单体间的U型交换产生，可能由微同源性介导的机制所介导。该过程可能产生了短暂的双着丝粒染色体，随后在细胞有丝分裂过程中断裂。产生的重复染色体可能通过端粒捕获（telomere capture）得以稳定，这与18q12.1q21.2三倍重复区域后接18q21.2q23 LOH的结果一致。三倍重复区域内的9个基因，包括SMAD2和SMAD4，显示出对剂量增加的高度预测敏感性，可能有助于临床表型的形成。该研究强调了LRS在定义复杂染色体重排中的实用性，并强调了分子断裂点分析对于理解致病机制和改善遗传产前诊断的重要性。
研究背景与问题提出：染色体微阵列分析（CMA）在产前和产后核型分析中的常规应用极大地改变了精细识别定量微小染色体变化的能力，如微缺失和微重复等通过细胞遗传学方法难以检测的变异。尽管CMA显著提升了诊断调查的能力，但其存在关键局限性：无法识别平衡的染色体畸变。复杂的新发三倍重复是导致大片段基因组改变的一类重要变异，属于复杂染色体重排（Complex Chromosomal Rearrangements, CCR/CGR），涉及三个或更多DNA断裂点，或由多个"简单"结构重排同时或相继发生形成。染色体内三倍重复导致部分四倍体虽属罕见事件，但已在多种染色体上有所报道，并与复杂表型相关。通常，反向基因组片段和复杂三倍重复重排由人类基因组中的反向重复序列介导。尽管此类重排具有重要的基因表达影响和临床后果，但仅有少数研究在分子水平上提供了复杂重排产生机制的验证模型。长读长测序（LRS）的应用使研究人员能够鉴定CCR的断裂点连接序列，揭示导致衍生染色体的分子机制，并定义重排涉及的基因组背景和基因。
关键技术与方法：该研究的主要技术方法包括：（1）常规G显带核型分析——对绒毛膜细胞和培养间充质细胞进行QFQ显带分析；（2）微阵列比较基因组杂交（array-CGH）结合SNP分析——使用Agilent GenetiSure Cyto 4×180K CGH+SNP芯片；（3）Oxford Nanopore Technologies（ONT）PromethION平台长读长测序——使用R10.4.1流通池进行纳米孔测序，采用minimap2进行序列比对，使用Clair3进行单核苷酸多态性（SNP）和小片段插入缺失变异检测，Spectre进行拷贝数变异（CNV）分析，Sniffles2进行结构变异（SV）检测；（4）PCR扩增结合Sanger测序验证断裂点连接序列；（5）生物信息学分析——包括 coverage profile计算、Integrative Genomics Viewer（IGV）可视化，以及pTriplo评分和OMIM数据库的表型-基因型关联分析。研究样本来源于一例29岁初产妇的绒毛膜样本，该胎儿因超声异常接受产前诊断。
研究结果：
临床描述与尸检发现：该胎儿表现为颈项透明层增厚（3.9 mm）、室间隔缺损和三尖瓣反流。联合筛查显示21三体高风险（1:12）。于孕12周行绒毛膜取样，孕16周自愿终止妊娠后行尸检。外部检查显示轻度面部畸形，包括眼距增宽和低置耳。最显著发现为左侧先天性膈疝（CDH），伴有肝脏、脾脏和腹腔内容物胸腔内疝出。脑部检查提示右侧顶叶神经元异位（neuronal heterotopia）及可能的皮质发育局灶性缺陷。
常规和分子核型分析：细胞遗传学分析显示女性核型伴异常18号染色体，定义为q12.2q22区域重复。在14个绒毛膜细胞中期分裂相中，11个显示异常核型46,XX,?dup(18)(q12.2q22)，3个为正常核型46,XX，提示低水平限制性胎盘嵌合体（CPM）或单绒毛膜消失双胎。培养间充质细胞的短串联重复序列（STR）分析排除了母体细胞污染（MCC）。Array-CGH进一步验证三倍重复区域为arr[GRCh38] 18q12.1q21.2(34509207_52782563)x4，以及18q21.2q23(54447020_80221686)x2hmz，即一个26 Mb的LOH区域从三倍重复远端延伸至18q端粒。该结果表明三个拷贝位于同一18号染色体上。
18q12.1q21.2四倍体的LRS分子特征分析：LRS确认了18q12.1q21.2区域三倍重复，CNV范围约为34,460,000 bp至52,859,000 bp（GRCh38/hg38），总大小18.4 Mb。LRS在断裂点连接区域检测到两个倒位。通过比对支持倒位的reads与参考基因组，确定两个倒位的起点和终点即为18 Mb CNV中间重复与两侧重复之间连接片段的断裂点。具体而言，第一个倒位的断裂点由嵌合reads确定，从chr18:34,460,465（正链或负链）至chr18:34,494,769（相反链），代表近端BP1和BP2，位于CNV第二和第三拷贝之间的连接处。第二个倒位的断裂点从chr18:52,858,932（一条链）至chr18:52,862,079（相反链），代表远端BP3和BP4，位于CNV第一和第二拷贝之间。嵌合reads的双向定位提示携带CNV的18号染色体具有三个串联重复，其中中间重复为反向。
PCR和Sanger测序验证了LRS结果。近端断裂点BP1和BP2位于2 bp微同源性序列内（相反链上chr18:34,460,465-34,460,466和chr18:34,494,753-34,494,754）。BP1位于NOL4和DTNA基因间区，BP2位于DTNA基因内含子1。远端BP3和BP4共享3 bp微同源性序列（相反链上chr18:52,858,930-52,858,932和chr18:52,866,374-52,866,376）。BP3位置获LRS确认，但BP4经Sanger测序发现与LRS初始鉴定位置不同，存在80 bp下游的4.2 kb缺失，该缺失与BP3、BP4均位于DCC基因内含子2，该内含子含有LTR49-int和L1PA7重复元件。
基于上述结果，研究人员推测BP1与BP2之间及BP3与BP4之间的序列以三个拷贝存在，这与LRS检测到的该区域的较低覆盖度一致（低于BP2-BP3区域的四拷贝覆盖度）。
产生18q12.1q21.2四倍体及18q21.2q23 LOH的潜在分子机制：该三倍重复片段的产生需要三色单体交换，由两个事件介导。LRS和Sanger测序鉴定了两个事件中涉及的序列，当以反向方向比对时显示50%同源性。
研究数据支持两个姐妹染色单体通过U型交换机制融合，可能由基于微同源性（microhomology）的机制介导，如复制叉停滞和模板切换及微同源性介导的断裂诱导复制（FoSTeS/MMBIR），或微同源性介导的末端连接（MMEJ），发生在S期。该事件涉及远端BP3和BP4序列，导致短暂双着丝粒染色体的形成和端着丝粒衍生片段的丢失。随后，双着丝粒染色体在有丝分裂后期于BP1或BP2处断裂，产生两个不等的染色单体：一个具有显著末端缺失（可能不稳定），另一个带有重复反向的18q12.1q21.2片段。含有重复的染色单体通过随后的端粒捕获（telomere capture）得以稳定，形成具有直接-反向-直接（direct-inverted-direct）方向三倍重复18q12.1q21.2区域的18号染色体。修饰后的染色体在~18 Mb的BP2-BP3区域有三个拷贝，在较短的BP1-BP2和BP3-BP4区域有两个拷贝。最后，与端粒捕获事件一致，array-CGH和LRS结果均显示三倍重复区域远端至18q端粒存在~26 Mb的LOH区域。
18q12.1q21.2基因含量研究：通过生物信息学方法，研究人员检查了18q12.1q21.2三倍重复区域内基因对胎儿表型的潜在贡献。选择pTriplo评分作为预测蛋白质编码基因三倍剂量敏感性的指标。该三倍重复区域涉及58个蛋白质编码基因，其中9个基因（MAPRE2、CELF4、SETBP1、SMAD2、ACAA2、MBD1、CXXC1、SMAD4、MEX3C）的pTriplo评分介于0.9至1之间，为与增加剂量不耐受相关的最大值。
讨论：研究人员提供了18q12.1q21.2三倍重复（导致部分四倍体）的分子特征描述，这是首次使用LRS对该重排进行描述。分子断裂点的定义为研究人员提供了理解重排机制的可能性，并能够表征染色体改变和确定涉及区域的范围。LRS的应用使研究人员能够解析这一具有多个断裂点的复杂重排的结构，确定三倍重复片段的方向，从而推测导致异常染色体的过程。
研究数据支持姐妹染色单体融合通过U型交换机制发生，可能发生在卵裂球阶段的S期有丝分裂过程中。鉴于远端BP3和BP4序列间发现的低同源性，在介导U型交换的潜在机制中，FoSTeS/MMBIR和MMEJ可能导致短暂双着丝粒的形成。双着丝粒染色体在有丝分裂断裂后，通过端粒捕获事件稳定含重复的染色单体，产生直接-反向-直接方向的三倍重复区域。
该胎儿表型与经典18三体综合征（Edwards综合征）呈现显著差异。尽管表现出CDH和轻度面部畸形等特定体征，但明显缺乏严重宫内生长受限（IUGR）、握拳伴手指重叠及摇椅足等18三体的典型特征。全18三体诱导复杂的全基因组基因表达改变，同时影响多个发育通路。相比之下，该病例涉及二倍体背景上的18q12.1q21.2区域部分四倍体。与DECIPHER数据库中相同染色体区间部分重复的比较进一步澄清了拷贝数剂量的关键作用。该病例呈现的致死性左侧CDH和神经元迁移缺陷（异位）提示，该区域基因的 tetrasomic 剂量（4个拷贝）——特别是TGF-beta通路中的SMAD2和SMAD4——超过了膈肌发育的临界阈值，导致比三体状态更严重的器官特异性表型。
研究人员推测，增殖驱动基因（如SETBP1、MAPRE2）的特异性扩增可能赋予间充质培养中的克隆选择性优势，掩盖了绒毛膜细胞分析中观察到的嵌合体。这突显了产前诊断中的关键局限性：分子方法只能检测所分析特定细胞样本中存在的嵌合体，这在组织间或培养诱导克隆选择后可能存在显著差异。同时，发育调节因子（如SMAD2和SMAD4）的过表达导致体内膈肌闭合的灾难性失败以及皮质发育的局灶性缺陷。
由于缺失父母知情同意，LRS分析未扩展至父母，因此无法排解在染色体来源识别上的疑问。14个绒毛膜细胞中检测到的3个正常46,XX细胞可能代表限制性胎盘嵌合体或单绒毛膜消失双胎。若正常细胞来自消失双胎，则重排染色体的形成可能通过减数分裂前S期或第一次减数分裂前期的三色单体交换机制解释，随后正常和重排染色体的减数分裂不分离可能导致合子三体状态，后通过三体挽救（trisomic rescue）伴随正常配子贡献染色体丢失而解决，这与18q端粒LOH区域的存在一致。尽管目前受较高成本限制，LRS对未来常规诊断具有巨大前景，可将工作流程简化为精确表征结构变异方向和断裂点的单一分析步骤。此外，在涉及LOH的病例中，基于三方的LRS分析对于确定畸变的父母来源和评估隐性等位基因揭示相关临床风险至关重要。
研究结论部分翻译：该研究通过LRS提供了18q12.1q21.2三倍重复（导致部分四倍体）的分子特征描述，这是首次使用LRS对该重排进行描述。分子断裂点的分析使研究人员能够阐明重排的可能机制，表征染色体改变并确定涉及区域的范围。LRS的应用成功解析了这一复杂重排的结构，确定了重复片段的方向，并支持了通过U型姐妹染色单体交换产生该畸变的假设。研究还鉴定了可能对临床表型有贡献的剂量敏感基因，特别是TGF-beta通路中的SMAD2和SMAD4。该研究强调了LRS在定义复杂染色体重排中的实用性，并强调了分子断裂点分析对于理解致病机制和改善遗传产前诊断的重要性。
