在提取前必须对人乳样本进行冷冻处理时保持RNA质量：一项多中心队列研究中所采用方法的验证

《Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia》：Preserving RNA quality when freezing of human milk samples must occur before extraction: Validation of methods utilized in a multi-center cohort study

　　

摘要

背景

最近的多中心研究旨在探讨孕妇血糖水平对乳腺功能及母乳成分的影响。通过检测母乳中的细胞基因表达，可作为一种液体活检方法来分析乳腺的分子生物学特征。为此，需要从母乳中高效、可重复地提取RNA，并制定统一的采样方案。为此，我们开展了一项研究，优化在多个中心采集样本后送至中央实验室进行处理和分析时的母乳RNA质量指标。

方法

在获得知情同意后，哺乳期母亲提供了母乳样本。样本处理方式如下：(1) 200 μL未冷冻的新鲜母乳作为对照组（FRESH）；(2) 1.7或5 mL的母乳先在冰上冷冻和解冻，然后再加入TRIzol（FRZ）；(3) 200 μL的母乳在加入TRIzol后再进行冷冻和解冻（FRZ 200）；(4) 200 μL的母乳中加入20 μL的RNA保存剂，再加入TRIzol后冷冻和解冻（FRZ + INH）。所有情况下均使用TRIzol提取RNA，随后用Qiagen RNeasy Mini试剂盒进行纯化。对于FRZ 200和FRZ 200 + INH组样本，是在解冻开始时直接加入TRIzol，再进行提取。评估指标包括RNA浓度、RNA纯度（260/280比值）、RNA片段化程度（DV 200）、RNA完整性数值（RIN）、基于Qubit荧光法的定量分析，以及通过Agilent TapeStation检测RNA大小。RIN值≥7被视为适用于转录组学研究的合格标准。RNA质量指标通过线性混合效应回归模型作为连续变量进行分析。

结果

FRESH组母乳（n=15）的估算边际均值RIN值为7.48（标准误0.29）。FRZ 200组（n=22）的RIN值为6.94（标准误0.26）。FRZ 200 + INH组样本（n=21）的RIN值为7.81（标准误0.26）。而FRZ组样本（n=19）的RNA完整性显著降低，RIN值为1.92（标准误0.26）。FRESH组与FRZ 200组、FRZ 200 + INH组的RIN值之间没有显著差异。相比FRZ 200组，FRZ 200 + INH组的RIN值有显著提升（p=0.0038）。所有处理组的RNA含量都足以用于后续测序。

结论

在解冻开始时直接向200 μL的母乳样本中加入TRIzol，能得到RNA完整性最高的母乳RNA，这一结果通过RIN值得以体现。在采样阶段、冷冻之前加入RN酶抑制剂也能提升RNA的完整性。我们开发出了优化冷冻人类母乳样本中RNA完整性的方法。这对于那些需要在提取和分析RNA之前冷冻母乳样本的多中心研究而言，是一项重要的方法改进。这些研究成果可为构建可靠的研究方案提供依据，从而评估母乳作为乳腺功能液体活检方法的可行性。