使用单程切向流过滤技术对模型病毒进行纯化与浓缩

《Biotechnology Progress》：Purification and concentration of model viruses using single-pass tangential flow filtration

　　

疫苗与病毒载体产业的快速发展催生了对高效收获及纯化工艺的需求。为改进相关技术，研究人员探索了基于膜操作的连续化工艺，包括正交流过滤（normal flow filtration, NFF）及用于浓缩的单程切向流过滤（single pass tangential flow filtration, SPTFF）。本研究以两种模型病毒为对象：非包膜猪细小病毒（porcine parvovirus, PPV）与包膜猪伪狂犬病病毒（Suid herpesvirus, SuHV），二者分别与基因治疗载体腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）及单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）同属一个病毒科。SPTFF设计始于批次切向流过滤（batch TFF）用于膜筛选。研究确定中空纤维膜的截留分子量（molecular weight cut off, MWCO）：PPV采用100 kDa，SuHV采用300 kDa。PPV的SPTFF运行未能实现病毒浓缩，且蛋白质与DNA去除率较低，与批次TFF结果不同。SuHV浓缩的最佳条件为两根中空纤维膜串联，流速10 mL/min、跨膜压力（transmembrane pressure, TMP）2 psi，可实现约100倍的滴度浓缩，蛋白质去除率为37%±5%，DNA去除率为32%±8%，该浓缩效果优于批次TFF，表明其对流速和跨膜压力具有强依赖性。NFF方面，研究人员开展了PPV与SuHV的滤器筛选及性能测试，并建立了中空纤维膜的清洗方案。本研究的最终目标是将此工艺整合入哺乳动物细胞培养生产的病毒载体的连续纯化流程中，以降低成本并提高通量。

疫苗与病毒载体制造业是生物技术产业的重要组成部分，具有巨大的市场价值和发展潜力。然而，在该领域的下游纯化环节，生产成本可占据总生产成本的70%之多，成为制约产业发展的关键瓶颈。这一瓶颈主要源于大分子生物物质纯化过程中色谱技术效率低下、回收率低等问题。为应对这些挑战，膜分离技术因其高可扩展性、相对低成本和低能耗等优势，被广泛应用于病毒产品的澄清、浓缩和换液等工艺环节。

传统的切向流过滤虽然在病毒浓缩方面已有诸多应用，但主要存在两个突出问题：一是批次操作模式需反复循环，可能导致病毒颗粒因高剪切应力或膜污染而失活，尤其包膜病毒更为敏感；二是膜孔径选择缺乏明确方法学指导，不同尺寸病毒的膜筛选存在经验性差异。为此，研究人员聚焦于开发单程切向流过滤技术，该技术采用长流路、低流速和低跨膜压力，溶液单次通过大面积膜即可完成分离，具有低剪切、高收率、操作简单等优势，有望实现与其他单元操作的连续整合，推动连续生物制造的发展。此外，研究人员还探索了正交流过滤作为预过滤步骤，以优化SPTFF操作并延长其使用寿命。基于此，研究人员以PPV（非包膜，直径18-26 nm）和SuHV（包膜，直径110-180 nm）为模型病毒，分别代表AAV和HSV等基因治疗载体，系统开展了膜筛选、SPTFF工艺优化以及NFF预过滤的研究工作。

研究采用的主要关键技术方法包括：以PK-13细胞和Vero细胞分别培养PPV和SuHV；采用MTT比色法测定病毒滴度；利用Bradford法和PicoGreen荧光法分别定量蛋白质和DNA；使用KrosFlo? KR2i TFF系统（配备蠕动泵、自动背压阀等）进行批次TFF和SPTFF操作，采用改性聚醚砜（m-PES）中空纤维膜（)m-MicroKros?模块，膜截留分子量涵盖50-500 kDa；NFF实验采用IPS-12系列注射泵配合多种品牌和孔径的注射器滤膜；通过标准化水渗透性（normalized water permeability, NWP）测试评估膜性能，并开发了NaOH-NaOCl清洗方案；使用应力控制振荡流变仪测定样品黏度，确保溶液流变学特性的一致性。

**3.1 传统TFF操作中的膜筛选**

膜截留分子量的筛选在标准循环式批次TFF模式下进行，以病毒感染性滴度回收率和宿主细胞蛋白及DNA去除率为评价指标。结果显示，所有测试MWCO（PPV：50、100、300 kDa；SuHV：100、300、500 kDa）均能完全回收PPV和SuHV（在MTT检测0.5 log的误差范围内），且100 kDa和500 kDa膜的SuHV渗透液中未检出病毒。鉴于病毒回收率无显著差异，研究人员进一步以蛋白质去除为确定MWCO的主要依据。PPV的蛋白质渗透回收率随MWCO增大而升高，但50 kDa和100 kDa膜的滞留液质量平衡未闭合，提示存在膜污染；SuHV的蛋白质滞留回收率在不同MWCO间无显著差异（29%-37%）。DNA去除方面，PPV无明确孔径依赖性趋势，100 kDa膜可能因污染导致滞留液和渗透液回收率均偏低；SuHV各MWCO间DNA去除率差异不大，但去除率超过50%。综合考虑，研究人员选定100 kDa MWCO用于PPV后续实验（宿主细胞蛋白去除率59%±2%，DNA去除率72%±0.1%），300 kDa MWCO用于SuHV。研究同时确认所有样品密度（1.01±0.01 g/mL）和黏度相近，且均为牛顿流体，保证了实验可比性。值得注意的是，所有测试中污染物在滞留液和渗透液中的总量均低于初始量，表明膜污染确实存在，但因实验时间较短尚未引起TMP的显著上升。

**3.2 单程切向流过滤**

SPTFF操作空间的确定涉及单根和两根中空纤维膜串联两种配置。新膜NWP测试显示，100 kDa和300 kDa单膜的渗透通量与TMP呈线性关系，分别可达4.6 psi和3.9 psi；串联两根膜后，线性范围分别降至3.3 psi和2.5 psi。渗透通量-TMP曲线呈现两个流动区域：低TMP区通量依赖于TMP，高TMP区通量独立于TMP，进入凝胶层控制区域。PPV在TMP大于4 psi时出现凝胶层，平均渗透通量47-55 LMH；SuHV在单膜低TMP下无渗透通量，但同样在约4 psi时出现凝胶层特征。

针对PPV和SuHV，研究人员分别测试了不同流速和TMP条件下的SPTFF性能。PPV方面，单膜和多膜配置、不同流速和TMP条件下，滞留液的感染性滴度与初始值相近，但均未实现病毒浓缩。即使增大进料体积至420 mL以延长稳态操作时间，仍未观察到时间依赖的浓缩效应。推测原因可能包括：所需测试体积更大，或病毒在凝胶层建立过程中损失；亦或MWCO相对于病毒尺寸偏大，病毒未能有效截留。蛋白质滞留回收率多数条件下较高（87%-99%），DNA去除率中等（55%-73%）。与文献报道的100 kDa膜可浓缩犬细小病毒2型（CPV-2）相比，PPV在批次TFF中表现更好，推测SPTFF中膜面积可能未达到病毒吸附饱和。

SuHV方面，单膜8 mL/min、3.5 psi条件下无浓缩；但单膜10 mL/min、5 psi条件下滴度增加近1 log；两根膜串联条件下滴度增加约2 log。最佳条件为两根膜串联、10 mL/min、2.0 psi（即2 psi TMP），可实现约100倍滴度浓缩，蛋白质去除率37%±5%，DNA去除率32%±8%，无病毒渗透损失。将TMP从2 psi增至5 psi时，宿主细胞蛋白和DNA残留显著增加，推测较高TMP促进了凝胶层形成，导致更多杂质被截留。与其他包膜病毒的传统TFF研究相比，如流感病毒300 kDa平膜4倍浓缩、慢病毒300 kDa平膜66倍浓缩，本研究在无血清培养基、大体积操作等简化条件下，以SPTFF模式实现了100倍浓缩，证明了该技术的可行性。

研究人员从过滤理论角度解释了最优操作条件：较高流速增强了病毒离开膜表面的 lift 力，而较低的TMP可能处于避免蛋白和病毒颗粒污染的关键平衡点，使切向流的清扫作用与垂直跨膜流动达到最优平衡。由于PPV尺寸更小，其lift力不足，总力平衡不利于浓缩。膜重复使用方面，研究人员开发了包含去离子水冲洗、0.5 N NaOH/150 ppm NaOCl清洗液50°C处理（正向-反向-正向流动）、最终水冲洗的三步清洗方案，膜性能恢复可达90%以上。

**3.3 病毒样品的NFF及滤器性能**

为降低SPTFF过程中的膜污染，研究人员探索了NFF作为预过滤步骤的可行性。PPV测试了多种Supor?滤膜（0.1、0.2、0.45、EKV 0.2、0.8、0.8/0.2 μm）及Nalgene? 0.8 μm CA滤膜，结果显示各滤膜对PPV滴度无显著影响，蛋白质去除率介于31.6%-41.8%之间，故选择孔径最大的Supor? 0.45 μm以减少早期污染。SuHV测试中，Supor? 0.1 μm和0.8/0.2 μm滤膜的渗透液中未检出病毒；0.45 μm滤膜有1 log去除；其余滤膜去除率低于1 log。综合考虑病毒回收和蛋白质去除，选择Puradisc? 1.0 μm用于SuHV预过滤。连续流动测试表明，PPV的Supor? 0.45 μm滤膜在20-30 min运行后因膜污染和过压而失效；SuHV的Puradisc? 1.0 μm滤膜在80 min测试期间通量稳定（平均145 LMH），可能与较大滤膜面积（4.2 cm² vs 2.8 cm²）有关。

**讨论与结论**

本研究旨在建立用于病毒疫苗和载体的连续预过滤及SPTFF浓缩工艺。针对非包膜和包膜两类模型病毒，研究人员探索了连续过滤操作的关键参数，并考察了NFF作为预过滤步骤的可行性。实验确定100 kDa MWCO中空纤维膜适用于PPV，300 kDa适用于SuHV；批次TFF中这些膜能在保留病毒滴度的同时实现较高的污染物去除率。SPTFF条件下PPV未实现显著浓缩，可能与病毒吸附、膜表面滤饼形成或膜孔径选择有关，需更大体积或进一步优化膜孔径。相反，SuHV在特定SPTFF条件下实现了100倍滴度提升，优于文献中类似病毒的批次TFF结果，证实了流速和TMP对包膜病毒浓缩的关键影响。

研究人员还建立了中空纤维膜的标准化清洗方案，以≥90%初始NWP恢复为重复使用标准，包含50°C碱-氯清洗液的多向流动处理，为降低操作成本提供了可行途径。NFF预过滤研究表明，PPV可采用0.45 μm滤膜但需关注连续操作中的早期失效问题；SuHV则需更大孔径（1.0 μm）以维持长期稳定通量。

研究结论指出，本SPTFF浓缩经验可为其他具有生物技术或临床重要性的类似病毒（如小RNA病毒科、甲型肝炎病毒以PPV为模型；HIV、流感病毒、慢病毒以SuHV为模型）的连续化SPTFF开发与实施提供参考。完整的过程建模有助于稳健预测预期回收率、浓缩倍数和污染物去除水平。PPV的膜孔径可能需要进一步优化，或更长运行时间可在滤饼建立后显示病毒浓缩效果。本工作仅使用了中空纤维膜，平膜可能提供不同视角。NFF结果凸显了孔径对连续长时间运行的重要性，以及采用更大孔径或深层滤器的潜在需求。未来需在不同流速和参数测量方面开展更多实验以优化过滤性能。将膜操作（NFF和TFF）与上游及后续纯化阶段整合，将推动高效疫苗和病毒载体连续生物工艺的实现。