肝细胞MLKL（Mixed Lineage Kinase Domain-Like Pseudokinase，MLKL）非经典功能促进衰老肝脏线粒体功能障碍与细胞衰老（A Non-Canonical Role for Hepatocyte MLKL in Promoting Mitochondrial Dysfunction and Senescence in the Aging Liver）

《Aging Cell》：A Non-Canonical Role for Hepatocyte MLKL in Promoting Mitochondrial Dysfunction and Senescence in the Aging Liver

　　

肝脏衰老的特征是慢性炎症和代谢功能障碍，驱动代谢功能障碍相关脂肪性肝病（Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease，MASLD）进展。由受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（Receptor-Interacting serine/threonine-Protein Kinase 1，RIPK1）-RIPK3-混合谱系激酶结构域样假激酶（Mixed Lineage Kinase domain Like pseudokinase，MLKL）通路介导的坏死性凋亡（necroptosis）是一种促炎性程序性细胞死亡形式，在衰老肝脏中被激活，全身抑制该通路可减轻肝脏炎症和病理改变。然而，坏死性凋亡通路在肝脏衰老中的细胞类型特异性作用尚不清楚。值得注意的是，代谢疾病状态下肝细胞中RIPK3被抑制，提示MLKL可能存在不依赖坏死性凋亡的功能。本研究显示，衰老肝细胞中MLKL表达升高，并通过非坏死性凋亡机制驱动肝脏衰老。利用肝细胞特异性MLKL过表达小鼠（MLKLHepOE），研究人员发现MLKL过表达不诱导坏死性凋亡，而是促进细胞衰老，表现为p16INK4a、p21WAF1/Cip1升高及衰老相关分泌表型（Senescence Associated Secretory Phenotype，SASP）增强。机制上，MLKL诱导肝细胞线粒体功能障碍，包括呼吸受损、线粒体动力学改变及活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）增加，表明氧化应激参与其作用。这种线粒体应激伴随促炎性细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）释放增加，并诱导肝细胞和非实质细胞的衰老。虽然肝细胞因数量优势贡献了大部分衰老负荷，但巨噬细胞是衰老富集的细胞群，提示非细胞自主性信号放大了衰老效应。综上，这些发现揭示了肝细胞MLKL通过线粒体功能障碍和旁分泌衰老信号促进肝脏炎性衰老的非致死、非坏死性凋亡功能，确定MLKL为肝脏衰老的调节因子及年龄相关性肝病的潜在治疗靶点。

论文解读：肝细胞MLKL非经典功能驱动肝脏衰老中线粒体功能障碍与多细胞衰老

研究背景与立题依据

肝脏衰老伴随慢性低度炎症（inflammaging）及代谢失调，是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD/MASH）及肝细胞癌发生的重要危险因素。坏死性凋亡（necroptosis）经由RIPK1-RIPK3-MLKL通路执行，被认为是衰老及相关肝病中DAMPs（Damage-Associated Molecular Patterns）释放及炎症放大重要来源，全身抑制该通路可减轻老年鼠肝脏炎症。然而，既往干预多为全身性基因敲除或药物抑制，肝细胞在肝脏衰老中是否及如何通过该通路发挥作用尚未明确。已有研究表明，在MASLD等代谢疾病状态下，肝细胞内RIPK3因表观遗传沉默而表达极低，提示经典坏死性凋亡在肝细胞中难以发生，MLKL可能具备不依赖于RIPK3/RIPK1的非经典功能。同时，生理及病理衰老肝脏中MLKL蛋白水平显著上调（约2~3倍）。基于此，研究人员假设肝细胞中升高的MLKL可通过非坏死性凋亡途径促进肝脏衰老，并构建肝细胞特异性MLKL过表达小鼠模型进行机制探究。该论文发表于《Aging Cell》。

主要关键技术方法

研究人员构建Rosa26位点Cre依赖型MLKL（Mlkl cDNA）条件性敲入小鼠，经尾静脉注射AAV8-TBG-Cre获得肝细胞特异性MLKL过表达小鼠（MLKL^HepOE），对照注射AAV8-TBG-Null；选用年轻（7月龄）及自然衰老（24月龄）野生型C57BL/6J小鼠（NIA老龄鼠队列）为生理衰老参照。分离原代肝细胞与非实质细胞（Non-Parenchymal Cells，NPCs）进行qPCR及Western blot验证细胞类型特异性。采用无标记定量蛋白质组学（Label Free Quantitative Proteomic Analysis）及靶向线粒体蛋白质组学分析肝组织差异表达蛋白及通路；进行肝脏非靶向脂质组学（Untargeted Lipidomics Analysis）；利用Seahorse XF96线粒体压力测试检测AML12肝细胞系线粒体耗氧率（Oxygen Consumption Rate，OCR）；以MitoSOX Red检测线粒体ROS；透射电镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）观察线粒体形态；活细胞成像结合光激活GFP（photoactivatable GFP，paGFP）及线粒体/溶酶体荧光报告系统评估线粒体动力学与线粒体自噬（mitophagy）；纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）检测细胞外囊泡（EVs）分泌；RNAscope RNA原位杂交及免疫荧光染色定位p16^INK4a（Cdkn2a）、p21^WAF1/Cip1（Cdkn1a）在各肝细胞类型中的分布；SPiDER-βGal检测衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescence-Associated β-Galactosidase，SA-β-Gal）活性；人血浆样本（青年、中年、老年及MASH患者）ELISA检测循环MLKL水平。

研究结果

3.1 Generation and Characterization of MLKL^HepOEMouse Model

通过AAV8-TBG-Cre诱导Rosa26-MLKL小鼠肝细胞特异性表达MLKL-FLAG，验证显示MLKL过表达仅限于肝脏且局限于肝细胞（mRNA升高9倍，蛋白约3.5倍），RIPK3在肝细胞中几乎不表达。证实模型构建成功，可用于研究肝细胞自主MLKL效应。

3.2 Hepatocyte-Specific MLKL Overexpression Does Not Induce Necroptosis, Apoptosis, or Liver Injury

MLKL^HepOE肝脏中未检测到磷酸化MLKL（p-MLKL）及磷酸化RIPK3（p-RIPK3），RIPK3蛋白在年轻小鼠肝组织中缺失；血浆ALT/AST无升高；TUNEL及cleaved caspase-3/PARP无变化；虽MLKL寡聚化（oligomerization）轻度增加但不引起膜破坏或细胞死亡。原代肝细胞中TBZ（TNFα+BV6+zVAD）无法诱导MLKL磷酸化（因缺RIPK3），而巨噬细胞可。结论：肝细胞MLKL过表达不引发经典坏死性凋亡或凋亡，属非致死性功能。

3.3 Impact of Hepatocyte MLKL Overexpression on the Liver Proteome

无标记定量蛋白质组学显示MLKL^HepOE肝与对照蛋白谱明显分离，差异蛋白涉及脂肪酸代谢、线粒体功能及氧化应激；通路富集最显著为细胞衰老相关通路（senescence-associated heterochromatin foci，SAHF；oncogene-induced senescence），疾病关联分析富集肝细胞癌及肝脂沉积。提示MLKL过表达引发衰老相关蛋白重塑。

3.4 Hepatocyte MLKL Overexpression Induces Multicellular Cellular Senescence in the Liver

MLKL^HepOE肝SA-β-Gal阳性增加；p16（Cdkn2a）、p15（Cdkn2b）、p21（Cdkn1a）mRNA及蛋白上调，p53仅蛋白轻度升；SASP因子（TNFα、IL1β、IFNγ、CXCL1、CXCL2、CXCL10）升高；F4/80⁺巨噬细胞浸润增多，M1标志物（CD68、CD11c、TLR4）上调。RNAscope显示p16/p21信号在Albumin⁺肝细胞（~2%~5%阳性）、Desmin⁺肝星状细胞及Pecam1⁺内皮细胞中均增加，Adgre1⁺巨噬细胞阳性比例最高（~12%），且绝对衰老细胞数中肝细胞因数量多是主要贡献者。结论：肝细胞MLKL过表达诱发多细胞（肝细胞+非实质细胞）衰老，巨噬细胞为衰老富集群。

3.5 MLKL Overexpression Induces Mitochondrial Dysfunction and Alters Lipid Metabolism and Promotes Steatosis in the Liver

自噬及NF-κB活化无变化，但氧化应激标志物4-HNE及硝基酪氨酸（Nitrotyrosine，NT）升高。AML12细胞MLKL过表达后线粒体基础、最大、ATP偶联呼吸及备用呼吸容量均下降；线粒体ROS升高2.5倍，MitoQ（线粒体靶向抗氧化剂 Mitoquinol Mesylate）处理可逆转ROS并改善呼吸。靶向线粒体蛋白质组示三羧酸循环及β氧化部分蛋白上调。脂质组学示甘油三酯（TG）、二酰甘油（DG）等升高。短期（5.5月龄）无脂肪变，长期（13月龄）出现脂滴增多及肝甘油三酯升高，CD36蛋白升高。结论：MLKL致线粒体呼吸障碍及ROS升高，长期引脂质代谢紊乱与脂肪变。

3.6 MLKL Overexpression Alters Mitochondrial Dynamics in the Liver

电镜见异常C形线粒体，面积无变；融合蛋白Mfn1、Mfn2、Fis1无变化，OPA1下调；Drp1（Dynamin-Related Protein 1）的Ser616及Ser637磷酸化比值升高，提示分裂偏向。paGFP示MLKL过表达细胞线粒体基质信号扩散加快（增强动态），LAMP1与线粒体共定位（mitophagy指标）无变，Parkin/PINK1无变。结论：MLKL扰乱线粒体融合-分裂平衡（促分裂、抑融合）而不影响mitophagy。

3.7 MLKL Overexpression Enhances EV Release Without Inducing Cell Death

AML12过表达MLKL不降存活率，但EVs分泌浓度升高（粒径不变），EVs含ALIX、TSG101、外源MLKL-FLAG及HMGB1（Damage-Associated Molecular Pattern分子）；随时间胞内MLKL降而EV中MLK升，提示MLKL经EV外排。HepG2敲低MLKL减EV释放。MLKL^HepOE小鼠血浆MLKL高于对照；人老年血浆及MASH患者血浆MLKL显著高于年轻健康人。结论：肝细胞MLKL以非致死方式促含促炎DAMP的EVs释放，可能介导旁分泌衰老信号。

讨论与结论总结（翻译研究结论部分）

衰老以慢性低度炎症（inflammaging）及代谢功能障碍为特征，共同促进MASLD及HCC等疾病。尽管MLKL最知名的身份是RIPK3依赖性坏死性凋亡的终末执行者，但累积证据表明MLKL还具有内吞运输、EV生物发生及自噬等非经典功能。本研究鉴定出肝细胞MLKL此前未被认识的作用——作为线粒体功能障碍、氧化应激、细胞衰老及旁分泌炎症信号的促成驱动因子，共同促进肝脏炎性衰老。利用年轻小鼠肝细胞特异性MLKL过表达获得功能模型，研究人员证明肝细胞MLKL升高足以在不引发坏死性凋亡前提下诱导肝脏衰老特征。生理衰老肝细胞中MLKL约升高2倍，MLKL^HepOE水平（~3.5倍）处于生理增高范围。MLKL^HepOE肝脏缺乏RIPK3、无RIPK3/MLKL磷酸化、无肝损伤，符合肝细胞中RIPK3表观沉默及MLKL非经典作用。机制上，肝细胞MLKL引起线粒体呼吸受损、Drp1磷酸化升高及OPA1降低（促分裂失衡）、C形线粒体异常、mtROS升高；MitoQ可挽救ROS及呼吸缺陷，支持mtROS为MLKL下游事件。线粒体应激伴HMGB1等经EVs释放，诱导邻近非实质细胞（尤其巨噬细胞）发生旁分泌/旁观者衰老，巨噬细胞虽少但p16/p21阳性率最高。综上，本研究揭示肝细胞MLKL通过引发线粒体功能障碍与氧化应激，并以含促炎组分的EVs旁分泌信号传播多细胞衰老，驱动肝脏炎性衰老——此为非坏死性凋亡、非致死的新功能；确立MLKL为肝脏衰老中线粒体及炎症稳态的调节因子，以及年龄相关肝病的潜在治疗靶点。