用于RNA后合成修饰的亲电尿苷(Uridine)构建模块——以自旋标记(Spin Labeling)为例

《Chemistry – A European Journal》：An Electrophilic Uridine Building Block for Post-Synthetic RNA Modification as Exemplified for Spin Labeling

　　

受广泛用于蛋白质标记的异硫氰酸酯(Isothiocyanate, ITC)偶联化学启发，研究人员描述了一种5-异硫氰酸甲酯基修饰尿苷(Uridine)构建模块的合成，其可实现RNA与伯胺(Primary Amine)的简便后合成修饰。ITC标记的常见概念基于亲电标记试剂，用于标记生物分子中具反应活性的氨基基团。本文中，研究人员提出"倒置"策略——即RNA携带亲电ITC官能团，可在固相合成完成后与带有伯氨基的各种标记试剂反应。5-位嘧啶环上的标记将非天然标签置于RNA大沟(Major Groove)中，从而确保对RNA折叠的最小扰动。该标记流程以Moloney小鼠白血病病毒(MMLV) 5′-前导区茎环C（36核苷酸(nt) SLCARNA）为例，使用4-氨基-2,2,6,6-四甲基-1-哌啶-1-氧自由基(TEMPO-NH2)为标记试剂进行了顺磁弛豫增强(Paramagnetic Relaxation Enhancement, PRE)研究。

本文解读基于发表于《Chemistry – A European Journal》的论文《An Electrophilic Uridine Building Block for Post-Synthetic RNA Modification as Exemplified for Spin Labeling》。

研究背景与意义

RNA的后合成修饰(Post-synthetic Modification)对拓展核糖核酸的结构与功能空间至关重要。目前常用的后合成修饰策略多为在RNA上引入亲核伯氨基，再与亲电试剂（如N-羟基琥珀酰亚胺酯或异硫氰酸酯ITC）偶联，或采用炔烃修饰结合点击化学(Click Chemistry)。然而，对于某些对酸性脱三苯甲基(Detritylation)、碱性解脱保护条件敏感的标签（如花菁Cy染料、若丹明、BODIPY及氮氧自由基自旋标记物），在固相合成过程中易降解失活。此外，传统将自旋标记直接引入固相合成用亚磷酰胺(Phosphoramidite)构建模块的做法，会使敏感自由基暴露于苛刻的合成试剂中而破坏。为此，研究人员开发了"倒置"策略：合成一种携带亲电5-异硫氰酸甲酯基(5-Isothiocyanatomethyl, 5-ITC)的尿苷(Uridine) RNA亚磷酰胺构建模块，将其通过固相合成掺入目标RNA，脱保护前用含伯氨基的探针（如TEMPO-NH₂）在固相载体上进行后合成硫脲(Thiourea)偶联标记，随后完成常规碱基与2′-保护基脱除。该策略将亲电位点置于双螺旋大沟，对RNA天然折叠扰动极小，适用于顺磁弛豫增强(Paramagnetic Relaxation Enhancement, PRE) NMR及电子顺磁共振(EPR)研究。

主要关键技术方法

研究人员以5-羟甲基尿苷衍生物为起始原料，经九步有机合成制备5-异硫氰酸甲酯基修饰的2′-O-TBDMS保护的尿苷RNA亚磷酰胺构建模块(化合物10)，并通过薄层色谱(TLC)验证异硫氰酸酯(ITC)基团在固相合成各试剂（4%二氯乙酸脱三苯甲基液、S-苄基硫代四唑活化剂、乙酰化盖帽液、碘氧化液）中的稳定性。将构建模块以延长偶联时间(6 min)掺入9 nt及36 nt MMLV 5′-Leader茎环C(SLC^A) RNA，优化后省略20%二乙胺(Diethylamine, DEA)氰乙基去除步骤，直接以50当量TEMPO-NH₂于无水DMSO中室温孵育固相载体结合RNA 16 h进行后合成标记，再依次用氨/甲胺混合液(AMA)及三乙胺三氢氟化物脱保护。产物经阴离子交换高效液相色谱(AIEX-HPLC)纯化及液相色谱-电喷雾电离质谱(LC-ESI-MS)鉴定。对¹⁵N/¹³C同位素标记的36 nt自旋标记RNA分别采集¹H NMR、¹H-¹⁵N SOFAST、¹H-¹H TOCSY及¹H-¹³C HSQC谱图，测定顺磁态与抗磁态信号强度比及横向弛豫速率(¹H-Γ₂)，并用HYDRONMR程序计算自旋标记距核苷质子距离并与建模结构比对。

研究结果

2.1 Synthetic Access to the 5-ITC-Methyl Uridine RNA Phosphoramidite 10 and Chemical Stability of the 5-ITC-Modified Uridine

研究人员从苯甲酰基保护的5-羟甲基尿苷衍生物出发，经DMT(4,4′-二甲氧基三苯甲基)保护、脱苯甲酰基、安装5′,3′-亚甲硅基(Silylene)及2′-O-叔丁基二甲基硅基(TBDMS)保护基、脱除临时保护基释放5-羟甲基、转化为新戊酰氧基(Pivaloyloxy)离去基、氨甲醇溶液70°C亲核取代得5-氨甲基尿苷、再与硫代光气(Thiophosgene)反应生成5-异硫氰酸甲酯基尿苷(化合物8，产率86%)，随后选择性脱除5′,3′-亚甲硅基保护基并重接DMT得化合物9(96%)，最后接2-氰乙氧基二异丙基氨基亚磷酰氯(CEP-Cl)制得RNA亚磷酰胺构建模块10(51%)。TLC实验显示化合物8在固相合成常用试剂（脱三苯甲基酸液、活化剂、盖帽A/B液、碘氧化液）中孵育1、15、30 min均保持单一斑点(R_f≈0.8, CH₂Cl₂/MeOH 95:5)，证明ITC官能团在RNA链组装条件下稳定。

2.2 Solid-Phase RNA Synthesis of 5-ITC-U-Modified RNA and Post-Synthetic Labeling Procedure

将构建模块10用于标准RNA自动合成（偶联时间延至6 min），三苯甲基离线检测显示掺入效率达98%–99%。初始尝试先用20%二乙胺/乙腈去除氰乙基保护基再进行TEMPO-NH₂标记，MS检测到二乙基硫脲(Urea)副产物而非目标产物；优化后省略二乙胺处理步骤，固相载体上直接用50 eq TEMPO-NH₂/DMSO室温16 h标记，继以AMA(37°C, 数小时)及Et₃N·3HF/DMSO(37°C, 16 h)脱保护，AIEX-HPLC及LC-ESI-MS确认获得正确质量的9 nt标记RNA。依此方案合成并标记含¹⁵N-A/U及5-D-6-¹³C-嘧啶稳定同位素标记的36 nt MMLV SLC^ARNA（RNA 11：^ITCU位于GUGA四环第16位；RNA 12：^ITCU替换螺旋区U31），成功获得TEMPO标记产物并经MS验证。

2.3 PRE NMR of TEMPO Tagged SLC^ARNAs

对RNA 11（^ITCU16位TEMPO标记，¹⁵N-A/U标记），¹H NMR亚氨基质子区抗磁/顺磁态对比显示G20有明显PRE效应；¹H-¹⁵N SOFAST长程H2-¹⁵N1腺嘌呤相关谱中A11、A12、A26、A27呈现显著PRE衰减，A19在顺磁态信号消失（长INEPT延迟下漂白效应显著），加抗坏血酸钠淬灭自由基后恢复；¹H-¹H TOCSY吡啶H5-H6区C13与U21有PRE效应，U14因交换展宽未检出。对RNA 12（^ITCU31位TEMPO标记，全U/C 5-D-6-¹³C嘧啶标记），¹H-¹³C HSQC谱测得U4、U8、C35的H6横向弛豫PRE速率(¹H-Γ₂)，其中U4为~32 s^?1，换算自旋标记距H6约15.5 ?，与基于已知SLC^A结构建模所得15 ?吻合；U8计算21 ? vs 建模20 ?，C35计算18 ? vs 建模17 ?，均相符。证实5-ITC-U后合成TEMPO标记可用于定量长程距离约束。

结论与讨论（翻译浓缩）

本研究建立了一种"倒置"策略——使用亲电5-异硫氰酸甲酯基修饰尿苷(5-ITC-U) RNA构建模块，可在目标核酸固相合成完成后进行后合成修饰。寡核苷酸可用带伯氨基的标签定点修饰，与固相载体上RNA反应生成稳定硫脲键。该方法以TEMPO-NH₂为标记试剂，对MMLV SLC^ARNA实施顺磁弛豫增强(PRE) NMR研究得以验证：优化的简易偶联流程（固相载体上50 eq标记试剂/DMSO, 16 h, 室温→标准碱性与氟化物脱保护）获得定量自旋标记，经MS确认。制备了两株具¹⁵N/¹³C标记及不同自旋标记位的SLC^ARNA，高质量PRE数据可给出定量弛豫增强效应及长程距离约束。该温和且结构扰动小的标记法将自由基标签置于寡核苷酸双螺旋大沟，RNA折叠仅微扰，是现有4-硫尿苷(4-Thiouridine, s⁴U)与MTSL(Maleimide-TEMPO Spin Label)共轭法的可行替代。此5-ITC-U构建模块亦可用于其他含伯氨基探针（荧光标签、纯化标签）及带伯氨基合成肽的缀合，以助细胞递送或改善药代动力学性质；并可同时引入双TEMPO标签供EPR距离测量，服务于整合结构生物学。