在线固相萃取联合液相色谱-串联质谱法定量检测15种增塑剂（包括邻苯二甲酸酯、DEHTP和DINCH）的21种尿液代谢物：一种稳健且经验证的方法

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：A robust and validated method for the determination of 21 urinary metabolites of 15 plasticizers, including phthalates, DEHTP, and DINCH, by online SPE and liquid chromatography-tandem mass spectrometry

　　

邻苯二甲酸酯（phthalates）及其替代增塑剂对苯二甲酸酯（terephthalates）和六氢邻苯二甲酸酯（hexahydrophthalates）广泛应用于消费品，导致人体持续暴露并存在潜在健康风险。本研究旨在建立一种分析测定方法，定量检测上述增塑剂的尿液代谢物作为暴露生物标志物。来自15种增塑剂的21种尿液代谢物，包括13种邻苯二甲酸酯、1种对苯二甲酸酯（di-2-ethylhexyl terephthalate, DEHTP）和1种六氢邻苯二甲酸酯（di-isononyl cyclohexane-1,2-dicarboxylate, DINCH），经酶解离后，在17种同位素标记内标（isotopically labeled internal standards）存在下，采用液相色谱-三重四极杆质谱联用技术（liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, LC-MS/MS）分离和定量。根据国际指南进行了完整的方法验证，并参加了外部能力验证测试。研究人员采集46份意大利普通成年人群尿液样本用于方法测试。分析物经酶解离后由在线固相萃取（online solid phase extraction, online SPE）富集；利用预分析柱延迟流动相中污染物干扰，色谱成功分离所有分析物。该测定方法精确（%相对标准偏差<% relative standard deviation, % RSD>在15.6%以内）、准确（相对于理论值的百分比在96.5%至108.5%之间）且灵敏，定量下限（lower limits of quantification, LLOQ）为0.10至0.78 μg/L。基质效应和长期储存带来的偏差对准确度影响可忽略，回收率为84%至111%。外部能力验证多轮测试均获成功。样本中浓度最高的代谢物为邻苯二甲酸单乙酯（monoethyl phthalate, MEP）、单(2-乙基-5-羧基戊基)对苯二甲酸酯（mono(2-ethyl-5-carboxypentyl) terephthalate, 5-cx-MEPTP）、邻苯二甲酸单丁酯（monobutyl phthalate, MnBP）和邻苯二甲酸单异丁酯（monoisobutyl phthalate, MiBP）（分别为38、11、8和8 μg/L）。所开发的方法表现出良好性能，结果准确且通量高，适用于普通人群大规模生物监测研究。

增塑剂的工业应用旨在改变聚合材料的物理机械性质以增强延展性与柔韧性。邻苯二甲酸酯及其替代增塑剂对苯二甲酸酯和六氢邻苯二甲酸酯广泛用于消费品，导致人体持续暴露。由于这些增塑剂未与聚合物基质化学结合，可迁移至食品和周围介质，人体通过经口、吸入及皮肤等途径暴露；吸收后迅速代谢为单酯并进一步氧化，代谢物主要以葡萄糖醛酸结合物（glucuronidated form）形式经尿液排泄。部分邻苯二甲酸酯具有内分泌干扰特性，对生殖健康、神经发育和代谢障碍的影响已引起公共卫生关注，多种物质因此受到欧盟《化学品注册、评估、授权和限制法规》（Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals, REACh）约束。与此同时，DEHTP和DINCH作为替代增塑剂被开发，欧洲生物监测数据显示传统邻苯二甲酸酯暴露下降，而DEHTP和DINCH暴露呈上升趋势。尽管尿液代谢物定量是评估人体暴露的首选方法，但现有分析仍面临挑战：消费品中增塑剂种类持续演变；某些增塑剂存在位置异构体（positional isomers），导致色谱峰簇部分重叠；增塑剂及其代谢物的普遍存在性污染可造成背景信号升高；此外，高通量、自动化的检测需求日益迫切。因此，建立适应当前增塑剂使用现状的分析方法对大规模人群生物监测具有重要意义。在此背景下，研究人员开发了一种液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）方法，定量检测21种增塑剂尿液代谢物，并在46份意大利普通人群尿液样本中进行了应用，论文发表于《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。

关键技术方法概括如下：该技术基于在线固相萃取（online SPE）与LC-MS/MS联用。尿液样本经β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase）酶解离后，由在线SPE系统（PLRP-S萃取柱）自动富集纯化；采用双预分析柱策略去除流动相污染物，即上游Poroshell 120 EC-C₁₈柱与下游Hypersil GOLD PFP柱（五氟苯基固定相）联用。色谱分离使用Accucore Phenyl-X柱，电喷雾电离源（ESI）负模式下进行计划多反应监测（scheduled MRM）。定量采用17种同位素标记内标校正，依据国际协调理事会（ICH）M10验证指南完成全面验证，并参加德国G-EQUAS外部质量评估计划。

研究结果部分按照原文结构与内容展开。

**Method optimization — Chromatography**

研究人员通过评估不同SPE和LC条件下的色谱图，最终确定乙腈（含0.1%甲酸）为最优有机改性剂，其相较甲醇体系提供了更优的峰分辨率与更锐利的峰形。位置异构体（5-OH-MEHP与5-OH-MEHTP、MiBP与MnBP、MEHP与MnOP）和功能异构体（OH-MiNP与5-cx-MEPTP、cx-MiNP与OH-MPHP）通过引入3.5分钟等度步骤（保留时间10.5至14.0分钟，55%水相）实现分离。OH-MiNP、cx-MiNP、7-OH-MINCH、7-oxo-MINCH、cx-MiDP和OH-MPHP六种分析物在真实尿液水解后呈现多峰色谱特征，反映商业混合物中多种异构体的存在；这些代谢物通过纯标准品保留时间窗口内异构簇总信号的整合进行定量，并通过离子比监测验证峰识别，重复性评估显示% RSD均在15%验证标准内。

**Online SPE clean-up and enrichment step**

研究人员测试了Strata-X、X-Bridge C₁₈和PLRP-S三种萃取柱。Strata-X表现最差，信噪比（S/N）最低、峰宽最宽、峰分辨率（R_s）最低；X-Bridge对大多数分析物表现相当但无法保留MMP。最终选择PLRP-S萃取柱，确定20%甲醇为最优载样有机相比例、100 μL为最优进样体积，可在不损害选择性和保留效率的前提下最大化灵敏度。

**Method validation — Enzymatic hydrolysis**

研究人员采用大肠杆菌来源的β-葡糖醛酸酶进行酶解离，通过监测4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide, 4-MUG）水解为4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone, 4-MU）评估效率，证明酸性淬灭可有效终止酶活性，1小时孵育确保完全解离。葡萄糖醛酸结合率显示，5-OH-MEHP、MiBP、MnBP、5-oxo-MEHP、OH-MiNP、7-OH-MINCH、MBzP、7-oxo-MINCH和MEHP的结合率接近完全（>88%），而MEP、5-cx-MEPP、5-OH-MEHTP、cx-MiNP和5-cx-MEPTP的结合率仅7%至59%，小分子代谢物、含羧基代谢物及DEHTP代谢物的结合率普遍较低。

**Method validation — Selectivity, carryover effect, and IS-interference**

在线SPE系统的实施需特定措施减轻背景干扰。C₁₈柱不足以保留上游污染物，五氟苯基固定相（Hypersil GOLD PFP）可有效延迟背景信号。携带效应、试剂和整体程序未引入显著干扰；但尿液基质本身含有MMP、MEP、5-OH-MEHP、5-cx-MEPP、MiBP、MnBP、5-OH-MEHTP、cx-MiNP和5-cx-MEPTP的可量化背景水平。内标浓度经优化以确保无非氘代类似物信号干扰。

**Method validation — Calibration curve, limits of quantification, precision, accuracy, long-term stability, and extraction recovery**

校准曲线线性良好，所有分析物决定系数（R²）>0.9895。LLOQ的精密度和准确度范围分别为2.4%至17.9%和89.2%至118.7%。日内精密度为1.0%至13.8%，日间精密度为2.0%至15.6%，日间准确度为96.5%至107.5%。6个月稳定性研究证实所有目标分析物保持稳定，准确度为85%至105%。提取回收率为90%至112%。

**Method validation — Matrix effect**

通过六份独立尿液样本评估个体间基质效应。14种分析物的斜率% RSD≤5%，表明基质效应可忽略；其余分析物为6.1%至13.9%。针对三个校准水平的进一步评估显示，除MnBP在低浓度水平因背景扣除导致84%准确度外，其余准确度为86%至111%。样本稀释引入的偏差为4%至6%，不影响定量。总体而言，基质效应得到有效控制。

**External verification**

研究人员参加德国G-EQUAS外部质量评估计划第66至75轮（第73轮除外）的能力验证，结果持续成功。特别是在第74和75轮中对大多数可用分析物进行了全面评估，进一步确认了方法的稳健性。

**Analysis of real urine samples**

该方法应用于46份意大利普通成年人群尿液样本，7-oxo-MINCH分析基于其中16份样本。15种代谢物在超过60%的样本中可定量，包括DINCH代谢物7-OH-MINCH及DEHTP代谢物。MnHxP、cx-MiDP和7-oxo-MINCH在17%至39%样本中检出，而MnPP、MCHP和MnOP持续低于LLOQ。浓度最高的代谢物为MEP（中位数38.44 μg/L，95^th百分位数1193 μg/L），其次为5-cx-MEPTP（11.01和51.00 μg/L）、MnBP（8.34和38.20 μg/L）和MiBP（8.29和24.49 μg/L）。结果证实了DEP、DEHTP、DnBP和DiBP的普遍暴露以及DINCH的广泛存在，但未显示当前对DnPP、DCHP和DNOP的暴露。数据与2015年至2021年HBM4EU项目框架下记录的欧洲暴露模式一致。

**Methodological considerations**

该方法表现出优良性能，但存在局限：总分析时间为25分钟，限制了样本通量；在线SPE虽减少样本处理并允许自动化，但需向LC-MS/MS装置添加专用阀系统；色谱性能可能通过采用超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography, UHPLC）进一步改善。异构体代谢物的定量仍具挑战性，多种物质共洗脱可能严重复杂化峰识别与积分；高分辨质谱（high-resolution mass spectrometry, HRMS）可通过设置狭窄质量容差提高选择性，区分功能异构体并排除同量异位基质干扰。该方法的主要优势在于使用真实人体尿液进行广泛验证，LLOQ在真实混合尿液中确定并经实验验证，确保报告限度真正代表常规分析性能。

**Conclusion**

本研究呈现了一种用于定量检测邻苯二甲酸酯、DEHTP和DINCH共21种尿液代谢物的高通量分析方法。方法的可靠性通过符合国际指南的内部验证以及成功参加G-EQUAS外部质量评估计划得到严格确认。关键挑战在于DiNP、DiDP和DINCH衍生的异构混合物色谱共洗脱问题，这通过整合规定洗脱窗口内异构峰的累积响应、利用离子比监测确保结构鉴定置信度得以有效解决。46份样本的分析揭示了普通人群中对受管控增塑剂以及DEHTP和DINCH等邻苯二甲酸酯替代品的广泛暴露。研究发现与欧洲生物监测数据的一致性证实了该方案在大规模研究中的适用性。