《Critical Reviews in Biotechnology》：Advances, challenges, and opportunities in engineering C5 and C6 sugar transporters in yeast for bio-based industrial biotechnology
利用生物质用于生物基工业生物技术对于满足全球能源需求和缓解气候变化至关重要。在此背景下，微生物是基于可再生材料的生物炼制厂的基石，在生物能源、农业、生物医学和其他领域具有广泛应用。通过改造代谢途径，可以定制微生物以提高产量、耐受工业条件并有选择地生产有价值的化合物。通过代谢工程和合成生物学的进步，已成功开发出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌株，能够高效转化戊糖D-木糖和L-阿拉伯糖。尽管取得了这一重要突破，这些糖的高效转运仍然是一个主要限制因素。酵母中的糖感应和转运在转录和翻译后水平受到调控。D-木糖不被识别为可发酵碳源，导致在缺乏细胞外葡萄糖的情况下，转运蛋白表达下调、从细胞质膜移除并通过泛素化降解。此外，与D-葡萄糖相比，转运蛋白对C5糖的亲和力较低，导致强烈的D-葡萄糖阻遏。为了应对这些挑战，研究人员已成功采用前沿策略，包括理性蛋白质工程、定向进化和机器学习方法，以扩展可用于酿酒酵母工程的C5转运蛋白库。特定的D-木糖转运蛋白已被重新设计，鉴定出关键残基以降低对D-葡萄糖的亲和力，同时研究证明了转运蛋白稳定性和糖摄取速率的改善。本综述总结了C5糖转运的关键瓶颈，并强调了在为创建能够进行可持续和高效生物基生产的稳健微生物平台方面取得的主要进展和进步。
引言
过去一个世纪，化石燃料的广泛使用显著增加了全球温室气体排放，导致前所未有的环境影响并加剧了气候变化的影响。这些问题促使人们努力开发可持续技术并向可再生能源和工业化学品生产转变。在此背景下，甘蔗、玉米和木质纤维素生物质等替代原料因其大规模部署潜力而备受关注。木质纤维素生物质作为一种具有成本效益且丰富的原材料在生物基产业中特别有前景。其复杂的结构包括纤维素、半纤维素和木质素，可分离以释放可发酵糖。纤维素部分由β-1,4-糖苷键连接的D-葡萄糖聚合物组成，而半纤维素是一种含有己糖（D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖）和戊糖（D-木糖、L-阿拉伯糖）的支化杂聚物。木质纤维素生物炼制厂旨在利用工程微生物平台将这些糖转化为生物燃料和高价值化学品。最近在微生物和基因组工程、代谢模型和合成生物学方面的进展导致了这些高性能微生物细胞工厂的发展。
在各种微生物平台中，芽殖酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)因其在工业条件下的卓越鲁棒性而脱颖而出，包括：耐低pH、氧化应激、高温和乙醇。作为GRAS指定的真核模型，酿酒酵母广泛用于发酵，并已广泛工程化以生产一系列生物产品，从疫苗和药物到生物燃料和有机酸。然而，野生型酿酒酵母菌株不能有效代谢D-木糖和L-阿拉伯糖等戊糖，这些糖在半纤维素水解过程中释放。虽然基因工程通过重新设计糖代谢途径已经能够消耗这些糖，但摄取仍然是主要瓶颈，限制了整体发酵效率和产物产量。
原核和真核细胞都具有复杂的转运系统，调节特定分子的流入和流出，包括营养物质、离子和代谢产物。糖分子通过专门的膜转运蛋白进入细胞，主要分为三个主要家族：(i) ATP结合盒(ABC)超家族，(ii) 主要易化超家族(MFS)，和(iii) 糖最终将被外排转运蛋白(SWEET)家族。ABC转运蛋白是ATP驱动的，逆浓度梯度转运溶质，而MFS转运蛋白通常作为易化转运蛋白发挥作用，通过单向转运（底物沿浓度梯度转运）、同向转运（转运与质子电化学梯度偶联）或反向转运（不同底物相反方向交换）运作。最后，SWEET转运蛋白家族最初在植物中发现，后来在厌氧真菌中发现，代表了一类新兴生物技术相关性的新类别。
酿酒酵母拥有18种内源性MFS转运蛋白（Hxt1p-Hxt17p和Gal2p），它们在多个分子水平上受到调控。其中一些，包括：Hxt1p、Hxt2p、Hxt4p、Hxt5p、Hxt7p和Gal2p，可以摄取D-木糖但亲和力低，并且受到D-葡萄糖的强烈抑制。这种葡萄糖阻遏延长了木质纤维素水解液中的发酵时间，并且泛素化导致的转运蛋白降解进一步限制了菌株效率。为了克服这些挑战，不同的策略集中在鉴定异源D-木糖转运蛋白和设计具有改进特异性和性能的膜蛋白。
本综述重点介绍了酿酒酵母中C5糖转运的最新进展，涵盖转运蛋白调控、工程策略和合成生物学方法以改善戊糖摄取。这些努力对于优化可持续生物加工平台中的酵母细胞工厂至关重要。
微生物代谢生物质来源的C5糖
D-木糖和L-阿拉伯糖是水解生物质中的主要五碳糖。全面了解C5糖代谢对于转基因生物(GMOs)有效 valorization 木质纤维素至关重要。由于其生产乙醇的多功能性，芽殖酵母酿酒酵母已成为从第二代(2G)工业残渣生产生物基化学品的重要平台。尽管酿酒酵母不能天然代谢C5糖，但酵母合成生物学的工程努力已经能够有效整合戊糖代谢途径。以下部分将讨论酵母用于C5糖代谢的一般途径，强调增强代谢流向磷酸戊糖途径(PPP)的策略。
D-木糖代谢
工程酵母菌株中的D-木糖代谢主要通过两种途径发生：氧化-还原(OXR)途径，常见于真核生物，和异构化(ISO)途径，主要存在于细菌中，尽管在丝状真菌中也发现了一些例子。OXR途径涉及D-木糖还原酶(XR)将D-木糖还原为D-木糖醇，随后D-木糖醇脱氢酶(XDH)将D-木糖醇氧化为D-木酮糖。木酮糖激酶(XKS)然后将D-木酮糖磷酸化为D-木酮糖-5-磷酸，进入磷酸戊糖途径(PPP)。一个关键限制是氧化还原失衡，例如Pichia stipitis XR使用NADPH但也可以使用NADH，而XDH是NAD+-依赖的，导致木糖醇积累。这可以通过使用具有更高NADH亲和力的XR来缓解，例如来自Spathaspora passalidarum的XYL1.2。ISO途径使用D-木糖异构酶(XI)将D-木糖直接转化为D-木酮糖，这是一种不依赖辅因子的反应，可减少木糖醇积累。早期在酿酒酵母中表达细菌XI基因的尝试导致低表达水平、差的生长速率和降低的乙醇生产率。进一步的研究已经利用真核基因作为增强酵母性能的替代策略。此外，包括增加基因拷贝数、酶工程和与共伴侣蛋白共表达以解决蛋白质错误折叠等策略已被证明是成功的。过表达XKS1与关键PPP组分可增强D-木糖发酵。此外，敲除醛糖还原酶基因GRE3也通过减少抑制D-木糖异构酶的木糖醇来改善D-木糖利用。适应性实验室进化(ALE)已在各种与MAPKKK信号传导、PKA信号传导和金属离子稳态相关的基因中鉴定出有益突变，这可以改善D-木糖代谢。细胞内二价阳离子（如Fe2+和Mn2+）可用性的增加也对工程xylA表达酵母细胞有利。
L-阿拉伯糖代谢
L-阿拉伯糖是木质纤维素水解液中第二丰富的C5糖，对2G工业可利用的碳水化合物池有重大贡献。类似于D-木糖，已通过代谢工程方法设计酵母菌株以代谢L-阿拉伯糖。为了开发能够消耗L-阿拉伯糖的菌株，研究了两种不同的代谢途径：氧化-还原(OXR-Ara)途径和异构化(ISO-Ara)途径。OXR-Ara途径主要存在于真菌中，涉及协调表达一系列酶，包括：醛糖还原酶(AR)、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(LAD)、L-木酮糖还原酶(LXR)和D-木酮糖还原酶(XDH)。相比之下，细菌ISO-Ara途径依赖于L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(araD)的功能性表达，通常存在于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌等细菌菌株中。在酿酒酵母中，两种途径都能将L-阿拉伯糖转化为木酮糖-5-磷酸，靶向磷酸戊糖途径(PPP)。此外，与消耗D-木糖的菌株一样，过表达PPP相关基因，如：RPE1、RKI1、TAL1和TKL1，已显示显著增加L-阿拉伯糖消耗率。此外，已在这些工程酵母细胞上进行ALE实验以提升其性能。与在消耗D-木糖的菌株中的发现相似，ALE已在消耗L-阿拉伯糖的细胞工厂中鉴定出增强C5消耗的特定遗传适应。这些进化菌株中报告的一个关键特征是在L-阿拉伯糖代谢途径中基因拷贝数增加，导致表达升高和改善的C5消耗。
理解天然糖转运蛋白在酵母D-木糖转运中的作用
酿酒酵母中的主要己糖转运蛋白属于主要易化超家族(MFS)，其特征在于12个疏水跨膜结构域，包括HXT家族（Hxt1p-17p），在糖转运系统中起关键作用。其中，七个转运蛋白（Hxt1p-7p）与Gal2p一起主要负责摄取：D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖，而其余的Hxt8p-Hxt17p可以在特定条件下转运糖，对甘露醇和山梨醇表现出中等亲和力。这些己糖转运蛋白按其对D-葡萄糖的亲和力分类：低（Hxt1p、Hxt3p；Km=40-100mM）、中等（Hxt4p、Hxt5p；Km=10-15mM）和高（Hxt2p、Hxt6p、Hxt7p和D-半乳糖通透酶Gal2p；Km=1-3mM）。虽然这些转运蛋白，包括Gal2p和Hxt1p-7p，通常对D-木糖的亲和力和特异性低于对D-葡萄糖，但Hxt7p和Gal2p在其中对D-木糖表现出相对较高的亲和力，然而仍然强烈偏好D-葡萄糖。这表明两种糖在摄取上存在竞争关系。这种竞争构成了生物质 valorization 的瓶颈，导致二次生长消耗模式，延长发酵时间。因此，努力集中在重新设计酵母转运系统以减少这种竞争。内源性糖转运蛋白的一个关键特征是其质膜可用性的调控。在进化过程中，酿酒酵母开发了复杂的、相互关联的机制，涉及营养感应、基因表达和翻译后修饰，以微调其对细胞外环境变化的响应，从而优化酵母细胞功能。
分子感应和内源性己糖转运蛋白的调控
在自然环境中，尽管糖的可用性多变，微生物必须有效摄取糖。酿酒酵母适应于使用七种主要转运蛋白（Hxt1p-Hxt7p）有效导入D-葡萄糖，具有不同的亲和力，受三个关键的D-葡萄糖信号通路严格调控：Snf3p/Rgt2p、Snf1p/Mig1p和cAMP/PKA。这些通路通过复杂的生化网络调控细胞内过程，如基因表达和蛋白质稳定性。
Snf3p/Rgt2p通路通过两个质膜传感器Snf3p和Rgt2p检测细胞外D-葡萄糖浓度。在D-葡萄糖存在下，机制始于D-葡萄糖分子与传感器结合，将无活性的Snf3p/Rgt2p转化为活性构象。这种变化激活酪蛋白激酶I复合物Yck1p/Yck2p，导致共阻遏物Mth1p和Std1p磷酸化和降解，最终通过从HXT启动子上释放Rgt1p来允许己糖转运蛋白的表达。
cAMP-PKA信号通路在高D-葡萄糖条件下活跃，调节细胞内cAMP浓度，激活或失活PKA。细胞外D-葡萄糖被跨膜受体Gpr1p识别，激活腺苷酸环化酶Cyr1p，并将ATP转化为cAMP。当激活时，PKA转位到细胞核，在四个假定的PKA共有序列处磷酸化Rgt1p，通过将其从DNA结合位点释放来抑制其阻遏功能。
与主要感应细胞外D-葡萄糖的Snf3p/Rgt2p和cAMP-PKA通路相反，Snf1p/Mig1p通路感应细胞内D-葡萄糖水平的变化，调控参与替代碳源代谢的基因。该网络中的关键参与者是Snf1p激酶复合物、Mig1p转录阻遏复合物和Reg1p-Glc7p蛋白磷酸酶I。Mig1p复合物与其靶基因启动子中的GC富集共有序列结合，与辅阻遏物Ssn6p(Cyc8p)和Tup1p一起抑制其转录。Mig1p还抑制参与替代碳源代谢的基因，如蔗糖转化酶SUC2。当Mig1p复合物被磷酸化时，它从DNA结合位点释放，允许基因表达。Snf1p是该通路中的关键酶，介导Mig1p的磷酸化。
Snf1p是酿酒酵母中的AMP活化激酶，在低D-葡萄糖条件下通过磷酸化而激活。在高D-葡萄糖条件下，Snf1p复合物被去磷酸化并失活。Reg1p-Glc7p复合物在细胞内D-葡萄糖水平高时去磷酸化并失活Snf1p。相反，在低D-葡萄糖条件下，Reg1p-Glc7p通过三种蛋白激酶Sak1p、Elm1p和Tos3p介导的磷酸化激活Snf1p。这三个信号通路检测不同的D-葡萄糖浓度，酿酒酵母的天然糖转运蛋白根据碳源和糖浓度表现出不同的表达模式。
大多数酿酒酵母内源性己糖转运蛋白，包括Hxt1p-7p和Gal2p，通过易化扩散发挥作用，因此不直接消耗ATP或依赖质子电化学梯度。在低或缺失D-葡萄糖条件下，细胞能量代谢间接影响糖摄取，通过维持有利于浓度梯度的细胞内代谢通量。因此，细胞的能量状态通过代谢需求而非直接能量偶联影响转运能力。质子偶联糖转运蛋白虽然在部分工程菌株中相关，但与天然易化扩散系统相比占少数。这种间接偶联已被认为是葡萄糖限制条件下戊糖利用的重要决定因素。
高D-葡萄糖浓度
在酿酒酵母中，高D-葡萄糖浓度诱导低亲和力D-葡萄糖转运蛋白Hxt1p的表达，主要通过Snf3p/Rgt2p和cAMP-PKA信号通路。这些通路在根据D-葡萄糖可用性调控己糖转运蛋白表达中至关重要。在高D-葡萄糖下，共阻遏物Mth1p和Std1p被Snf3p/Rgt2p通路降解，阻止它们抑制Rgt1p，Rgt1p是调控HXT基因的转录阻遏物。同时，cAMP-PKA通路过度磷酸化Rgt1p，进一步增强HXT1表达。然而，过度磷酸化的Rgt1p刺激该转录因子并促进完全HXT1表达的精确机制仍不清楚。高亲和力转运蛋白如Hxt6p和Hxt7p，以及中等亲和力转运蛋白Hxt2p和Hxt4p，被Mig1p和Mig2p阻遏。Mig1p和Mig2p都阻遏HXT6/7，尽管Mig2p在2%至10%D-葡萄糖浓度之间的阻遏中起更突出的作用。有趣的是，只有Mig1p在2%D-葡萄糖时阻遏HXT4，而在10%D-葡萄糖时，Mig2p成为主要阻遏物。
低D-葡萄糖浓度
在低D-葡萄糖条件下，酿酒酵母细胞通过上调高亲和力D-葡萄糖转运蛋白如Hxt6p和Hxt7p来适应。这种适应对于营养物质稀缺时有效摄取D-葡萄糖至关重要。Snf1p激酶在低D-葡萄糖水平下被激活，磷酸化并失活阻遏物Mig1p。一旦Mig1p被磷酸化，它被从细胞核输出，允许高亲和力HXT基因的转录。中等亲和力转运蛋白如Hxt2p和Hxt4p仅在低D-葡萄糖条件下表达。它们的表达需要同时失活Snf3p/Rgt2p和Snf1p/Mig1p通路，确保多种转运蛋白能有效捕获可用的D-葡萄糖。
D-葡萄糖缺失
在没有D-葡萄糖的情况下，酿酒酵母细胞阻遏己糖转运蛋白的表达，因为维持这些转运蛋白在能量上是昂贵的。无活性的腺苷酸环化酶Cyr1p导致低cAMP水平，维持PKA处于非活性形式。这种情况导致Rgt1p低磷酸化，其与共阻遏物Mth1p和Std1p一起结合到HXT启动子，抑制其表达。Snf1p/Mig1p通路通过磷酸化和输出Mig1p发挥关键作用，从而防止其阻遏活性。因此，参与替代碳代谢的基因，如SUC2，被表达，使细胞能够在D-葡萄糖缺失时有效利用其他碳源。
替代HXT调控机制
尽管Hxt3p转运蛋白表现出低D-葡萄糖亲和力，但其表达仅依赖于D-葡萄糖的存在。换句话说，糖水平的波动对其表达影响极小；相反，任何浓度的D-葡萄糖存在都会触发细胞内信号促进该基因的转录。这种调控可能是由于Rgt1p对HXT3表达的控制，使其仅依赖Snf3p/Rgt2p信号系统。当D-葡萄糖存在时，分别代表低和高亲和力传感器的Snf3p和Rgt2p靶向Mth1p和Std1p降解。结果，Rgt1p可用于被Snf1p或PKA磷酸化，取决于低或高D-葡萄糖条件。这种磷酸化导致Rgt1p从HXT3启动子结合位点释放，从而去阻遏基因表达。
与HXT1-4和HXT6-7相反，HXT5的表达似乎不受D-葡萄糖浓度直接调控。相反，它主要在诱导最小生长速率的条件下表达，如碳或氮饥饿、细胞产孢以及暴露于非发酵碳源如甘油和乙醇。
翻译后调控糖转运蛋白
翻译后下调对于维持酿酒酵母的细胞功能至关重要。主要的D-葡萄糖信号通路——Rgt2/Snf3、AMPK和cAMP-PKA——不仅调控基因表达，还调控糖转运蛋白的翻译后下调，根据葡萄糖可用性平衡其表达水平。当D-葡萄糖浓度高时，高亲和力转运蛋白如Hxt2p和Hxt6p变得不必要并被靶向降解。PKA通路已知在翻译前调控HXT基因表达，也在D-葡萄糖饥饿下参与转运蛋白如Hxt1p的翻译后下调，表明双重调控功能。
泛素依赖的降解是标记蛋白质降解的主要途径。泛素化涉及将泛素（一种由76个氨基酸组成的高度保守多肽）附着到目标蛋白的赖氨酸残基上，标记它们进行内吞和随后的降解或回收。两个关键的泛素结合位点是Lys48(K48)，与蛋白酶体降解相关，和Lys63(K63)，与液泡降解和膜运输相关。在内吞过程中，网格蛋白包被的凹坑围绕转运蛋白形成，导致内体形成。转运蛋白的单泛素化对其回收特别重要，这一过程由小GTP酶(Rabs)促进，有助于囊泡形成、蛋白质运输和膜回收。
泛素化蛋白的命运取决于泛素连接类型。单泛素化促进内吞或重新定位，而多泛素化（一条泛素链附着到单个赖氨酸上）将蛋白质靶向降解。具有K63连接的蛋白质通常被导向液泡降解。早期内体成熟为晚期内体并与多泡体(MVBs)融合导致液泡降解。类似的过程发生在K48多泛素化的蛋白质上并遵循降解途径。然而，与K63通路相反，在早期内体成熟后，转运蛋白被送到26S蛋白酶体，这是最复杂的蛋白酶之一，其主要功能是降解泛素-蛋白质偶联物。
在没有D-葡萄糖的情况下，即使存在替代碳源，工程转运蛋白也会下调。将赖氨酸残基突变为精氨酸（Lys-to-Arg）抑制泛素结合，产生泛素抗性蛋白。这种方法已有效用于防止蛋白质下调。例如，将Lys-to-Arg突变引入嵌合转运蛋白Hxt36p抑制了其降解。类似地，具有赖氨酸突变的Hxt1p和Hxt5p表现出改善的膜定位和降低的液泡降解。
糖转运蛋白的翻译前和翻译后调控是相互关联且对维持酿酒酵母细胞稳态至关重要的。主要的D-葡萄糖信号通路（Rgt2/Snf3、AMPK和cAMP-PKA）在这些过程中起双重作用。它们翻译前调控基因表达，例如通过失活Rgt1阻遏物调控Hxt1-Hxt4，并在不再需要时通过翻译后修饰转运蛋白下调其活性。这种翻译前和翻译后调控机制之间的复杂相互作用对酿酒酵母的细胞稳态至关重要。
通过理解D-葡萄糖信号通路如何调节转运蛋白表达和功能，研究人员可以更好地理解发酵过程中底物竞争带来的挑战。这种理解为重新设计糖转运系统的创新方法奠定了基础。
重新设计酿酒酵母糖转运系统
重新设计跨越质膜的底物摄取机制对于开发稳健的2G酵母平台至关重要。C6和C5糖摄取之间的激烈竞争显著影响生物产物产量并延长发酵时间。为了克服这一挑战，已采用各种基因工程策略来微调转运蛋白对C5糖的特异性。多年来，涉及在HXT-null酵母菌株中评估个体假定糖转运蛋白的研究导致了几种新型异源C5转运蛋白的发现。
这些新鉴定的C5转运蛋白许多是从天然D-木糖发酵微生物组的微生物中分离的。此外，进化工程技术，如适应性和定向进化，已广泛用于增强酿酒酵母中的糖转运系统。在以下部分，研究人员将探讨当前用于重塑酵母糖转运系统以优化生物质来源糖摄取的研究方法。
HXT-null整合分析C5转运蛋白
糖转运蛋白的发现和功析传统上依赖于称为HXT-null菌株的己糖转运缺陷酵母菌株，这些菌株被设计为缺乏转运D-葡萄糖和其他C6/C5糖的能力。这允许重新引入个体转运蛋白以分析特定特性和底物亲和力。
第一个HXT-null菌株RE700A是通过删除关键己糖转运蛋白（Hxt1p-Hxt7p）创建的，严重损害了D-葡萄糖摄取，使其成为研究转运蛋白特性的理想平台。KY73菌株来源于RE700A，额外删除了GAL2基因（D-半乳糖转运蛋白），增强了这些研究，但仍表现出在D-葡萄糖上的残留生长。为了研究D-木糖发酵，DLG-K1菌株从KY73开发，结合了XR、XDH和木酮糖激酶酶（来自S. stipitis的XYL1、XYL2和来自S. cerevisiae的XKS1）的过表达。研究表明，Hxt1p适合D-葡萄糖/D-木糖混合物，而Hxt7p在富含D-木糖的条件下表现更好。
广泛使用的EBY.VW4000，一种CEN.PK菌株，具有18个己糖（HXT1-17、GAL2）和3个麦芽糖转运蛋白（AGT1、YDL247和YJR160）的缺失，对于发现和表征新型糖转运蛋白至关重要。它对于表达非天然转运蛋白如Gxf1p和Gxs1p（来自Candida intermedia）至关重要，这些转运蛋白恢复了D-木糖培养基中的生长以及D-木糖利用途径的表达。EBY.VW4000也是表征和筛选来自不同微生物来源的36个假定D-木糖转运蛋白的平台。然而，其构建涉及16轮Cre/LoxP-based缺失，导致染色体重排如新染色体形成和亚端粒区域丢失，这对细胞生长和生理产生负面影响。
为了克服这些表型问题，IMX1812菌株使用CRISPR-Cas9开发，删除了相同的21个基因而没有诱导染色体重排。IMX1812在己糖和戊糖上没有生长，证明了其作为测试异源转运蛋白背景菌株的前景。创建了HXT-null样菌株IMX1504，通过从L-阿拉伯糖利用菌株IMX928中删除GAL2来评估L-阿拉伯糖转运蛋白，促进了PcAraT（来自Penicillium chrysogenum）的表征，尽管目前专门用于L-阿拉伯糖转运蛋白研究的菌株很少。
HXT-null菌株的开发历来侧重于实验室菌株作为主要背景。最近，设计了两种来自工业背景的创新HXT-null菌株，能够发酵D-木糖和L-阿拉伯糖，为工业相关发酵过程提供了更现实的模型。第一种菌株是D-木糖特异性变体，结合了优化的D-木糖发酵途径和D-木糖剂量依赖性生物传感器，预计能够实现转运蛋白动力学的实时、高通量筛选。第二种菌株来源于阿拉伯糖发酵背景，删除了GAL2基因，损害阿拉伯糖摄取，能够精确表征新型阿拉伯糖特异性转运蛋白。
总体而言，HXT-null菌株随着CRISPR-Cas9等合成生物学工具不断发展，对于理解酵母中的糖转运蛋白仍然至关重要，并为推进糖摄取机制和工业应用提供了宝贵平台。
利用自然多样性中的糖转运蛋白
高效的戊糖摄取仍然是木质纤维素生物炼制厂的主要挑战。一种策略是利用来自天然D-木糖和L-阿拉伯糖发酵微生物的糖转运蛋白。值得注意的是，微生物物种，如Scheffersomyces stipitis、Spathaspora passalidarum、Candida intermedia、Neurospora crassa、Debaryomyces hansenii、Aspergillus niger和Trichoderma reesei，由于其天然代谢D-木糖的能力而特别令人关注。这些生物的转运系统已被广泛研究，导致了几种在酵母代谢工程中具有潜在应用的转运蛋白的发现。
在S. stipitis中，转运蛋白如XUT1、XUT3、SUT1、XYP29、SUT2、RGT2和SUT3，在D-木糖转运中显示出不同程度的亲和力和效率。特别是XUT1，尽管对D-木糖表现出更高的偏好，但在酿酒酵母中表达时被表征为低转运效率。来自C. intermedia的Gxf1p（一种D-葡萄糖/D-木糖易化转运蛋白）和Gxs1p（一种高亲和力D-木糖同向转运蛋白）已被广泛研究。Gxf1p常用于工程菌株，但其性能在高D-木糖浓度下下降，可能由于泛素化。另一方面，来自Candida sojae的Cs4130p转运蛋白在高D-木糖水平下表现良好，但仍然偏好D-葡萄糖，限制了两种糖的共同利用。
来自其他生物（包括植物和细菌）的转运蛋白提供了额外的多样性。虽然几个拟南芥转运蛋白在大多数酵母菌株中表现出有限的摄取，但在BY4727菌株中可以看到一些改善。大肠杆菌的XylE，一种具有高亲和力且具有阐明晶体结构的MFS转运蛋白，是详细转运蛋白建模的范例。然而，细菌转运蛋白在酵母中的功能性表达仍然具有挑战性，经常导致蛋白质折叠和无功能问题。
最近，最初在植物中发现的SWEET转运蛋白已在厌氧真菌（Neocallimastigomycota）中被鉴定。值得注意的是，NcSWEET和优化的嵌合变体（NcSW1/PfSW2:TM5-7）使酵母能够共同利用D-葡萄糖和D-木糖，代表了生物炼制厂的一个有希望的进展。
尽管取得了这些进展，关键挑战仍然存在：在酵母中的异源表达和对D-葡萄糖的持续偏好。解决这些问题将需要靶向工程，通过理性设计、适应性进化或定向进化，以增强戊糖特异性和转运蛋白性能。继续挖掘自然多样性，与合成生物学结合，有望推进糖转运蛋白的开发。
通过计算和机器学习方法发现D-木糖转运蛋白
生物信息学和机器学习方法已被用作转运蛋白发现的强大工具。这些方法可以识别与D-木糖转运相关的序列特征并指导功能预测。在最近的一项研究中，比较基因组学和机器学习应用于182个Saccharomycotina酵母基因组。使用包含25个经验证用于D-木糖摄取的转运蛋白的训练集，该模型构建了识别预测转运活性的关键序列基序。选择了四种新型转运蛋白（SpG、SpH、SuL和SpX）并在HXT-null菌株（EBY_Xyl1）中表达，其中SpG、SpH和SpX在D-木糖摄取中优于众所周知的Gxf1p。迄今为止，这标志着首次使用机器学习成功预测和验证新型D-木糖转运蛋白。随着数据集的扩展，机器学习将进一步强化转运蛋白发现流程，加速优化用于木质纤维素生物质转化的菌株开发。
糖转运蛋白的理性设计和定向进化
改造糖转运蛋白以增强酿酒酵母中C5和C6糖摄取对于基于酵母的生物炼制厂的进步至关重要。天然存在的转运蛋白基因突变可以改变氨基酸序列并影响转运蛋白活性。改善底物利用的有益突变往往通过自然选择固定。定向进化通过生成转运蛋白变体文库并筛选改进特性（特别是克服D-葡萄糖抑制的能力，这是混合糖发酵中的主要挑战）来复制这一过程。
易错PCR是创建突变文库的常用技术，使用低保真聚合酶在次优条件下引入随机突变。这种方法已产生改进的转运蛋白变体，包括内源性Gal2p，产生了具有增强D-木糖亲和力和降低D-葡萄糖摄取的版本。另一项研究应用该技术工程化来自拟南芥的AtSweet1转运蛋白，产生了特异性D-木糖转运突变体。该工程转运蛋白用于构建仅消耗D-木糖的专家酵母菌株，受D-葡萄糖干扰最小。此外，通过采用共培养方法，将该D-木糖专家与D-葡萄糖专家菌株共培养，系统在发酵过程中实现了两种糖的同时有效消耗。因此，这些发现证明了随机诱变用于进化具有修饰底物偏好的转运蛋白的潜力。
或者，与易错PCR的随机性不同，定点诱变允许在关键残基处进行精确修饰。合理设计的含有简并密码子（例如NNN或NNK）的寡核苷酸可以在单个位点编码多个替换，实现蛋白质功能的微调。例如，Neurospora crassa AN25转运蛋白的靶向进化产生了变体，其D-木糖摄取增加43倍，并对D-葡萄糖竞争完全抵抗。
这些互补的方法，随机和靶向诱变，突出了根据工业酵母菌株的代谢需求定制转运蛋白的重要性，从而实现C5和C6糖的有效共利用。
用于转运蛋白改进的适应性实验室进化
当理性工程证明不足时，ALE作为强大的替代方案。通过施加连续的选择压力，ALE驱动有益突变的积累，从而增强糖转运效率。这对于进化对戊糖如D-木糖和L-阿拉伯糖具有高特异性同时最小化对D-葡萄糖亲和力的转运蛋白特别有用。
典型的ALE设置需要：(i) 删除主要己糖转运蛋白，(ii) 引入功能性D-木糖途径，和(iii) 失活D-葡萄糖代谢。这创造了有利于有效摄取D-木糖转运蛋白的选择压力。Farwick等人(2014)使用此策略进化出具有改善D-木糖转运的Gal2p和Hxt7p变体。Gal2pN376F突变体表现出对葡萄糖不敏感的D-木糖摄取，可能是由于改变的范德华力相互作用破坏了D-葡萄糖结合。
Nijland等人(2018)通过进化具有删除己糖激酶但完整糖转运蛋白的菌株推进了这一概念。他们鉴定了一种嵌合转运蛋白(Hxt36p)，具有关键的N367A突变，模拟了Gal2p中N376F替代的功能效应。这些研究强调了一个保守的天冬酰胺残基对于工程不敏感于葡萄糖的木糖转运蛋白至关重要。ALE因此通过实现适应性突变的发现来补充理性设计，这些突变在现实发酵条件下改善转运蛋白特异性和功能。
对D-木糖摄取至关重要的保守残基和基序
转运蛋白工程努力反复集中在对于C5糖摄取至关重要的保守残基和基序上。MFS家族转运蛋白之间结构相似性——特别是在其跨膜结构域中——允许功能见解的推广。关键残基如Mgt05196p中的D72和R164被认为形成调节孔开口的极性相互作用，而F432和N360的突变增强D-木糖转运。一个高度保守的天冬酰胺（例如Mgt05196p中的N360、Gal2p中的N376、HXT7p中的N370以及Gxf1p/Cs4130p中的N349）在区分D-木糖和D-葡萄糖中起关键作用。改变该残基削弱了与D-葡萄糖C6碳的范德华力相互作用，降低葡萄糖摄取而不影响D-木糖转运。将ALE与在该保守位点的定点诱变结合已产生Gxf1p和Cs4130p变体，其独立转运D-木糖而不受D-葡萄糖阻遏。该残基仍然是理性转运蛋白工程的核心靶点。
其他关键残基也已出现。在Trichoderma reesei Xltr1p中，Q288A消除了D-木糖转运，而N434突变破坏了己糖和戊糖摄取，强调需要平衡特异性和效率。两个保守基序进一步影响转运蛋白功能。位于TM1的G-G/F-XXXG基序对D-木糖摄取至关重要，并可优化以获得更好的选择性。Mgt05196p的TM7中的YFFYY基序在转运过程中稳定D-木糖。诸如Xltr1p中的FIFYY等变体由于关键芳香位置处的替换而表现出改变的基序结合，诱变研究证实了它们在转运蛋白构象和功能中的关键作用。
L-阿拉伯糖转运及酵母中的分子机制
L-阿拉伯糖摄取在酿酒酵母中由天然转运蛋白促进，例如D-半乳糖通透酶Gal2p，其被认为是L-阿拉伯糖的关键转运蛋白，尽管仅表达Gal2p的菌株可以以低效率摄取和代谢L-阿拉伯糖，因为其对该糖的亲和力较低。为了改善糖摄取，通常表达来自L-阿拉伯糖消耗生物的异源转运蛋白。过表达Hxt9p和Hxt10p可以增强L-阿拉伯糖摄取，但速率和亲和力低于Gal2p，并且两者都被D-葡萄糖抑制。
虽然与D-木糖转运蛋白相比，表征的异源L-阿拉伯糖转运蛋白较少，但真核转运蛋白，如AXT1、LAT1、LAT2、PcAraT、Stp2和Str3，已改善重组酵母菌株中的L-阿拉伯糖摄取，尽管增强仍不足以用于工业应用，并受到错误折叠、泛素化、失调以及对D-半乳糖和D-葡萄糖更高亲和力的影响。
靶向特定氨基酸残基，特别是Gal2p中的F85残基，已显示改善转运蛋白-底物亲和力，包括突变如F85S、F85G、F85C和F85T，显著增强L-阿拉伯糖摄取。其中，F85S对改善L-阿拉伯糖和D-木糖生长速率影响最大，而F85G增加L-阿拉伯糖转运并降低对D-木糖和D-葡萄糖的亲和力。Cas9工程酿酒酵母菌株的适应性进化，其中D-葡萄糖磷酸化被破坏，并表达了来自植物乳杆菌的L-阿拉伯糖代谢途径以及异源转运蛋白PcAraT，导致GAL2基因重复和特定突变的出现。这些包括Gal2pN376S、Gal2pN376T和Gal2pN376I，其表现出对D-葡萄糖的敏感性降低。其中，Gal2pN376I使D-葡萄糖和L-阿拉伯糖的共同同化成为可能。双突变体Gal2pT89I/N376T表现出优异的L-阿拉伯糖摄取，完全丧失D-葡萄糖转运，以及对L-阿拉伯糖更低的Km和Vmax值。这些发现表明，可以通过具有互补特性的转运蛋白组合来实现最佳的L-阿拉伯糖消耗谱。
揭示C5糖转运蛋白的结构机制
理解糖转运蛋白的结构和功能对于改善其生物技术性能至关重要。只有少数真核糖转运蛋白，如人GLUT1、真菌PiPT和植物NRT1.1/STP10，已被结构解析，而对于D-木糖转运蛋白，仅有原核例子如来自大肠杆菌的XylE被表征。这种结构知识的差距显著限制了研究人员对真核转运蛋白中D-木糖摄取机制的理解。
使用来自先前解析结构的同源模型的计算机结构预测受到原核和真核转运蛋白之间差异的限制，使得确定这些真核结构至关重要。虽然跨膜蛋白质的晶体结构很困难，因为获得高质量晶体的挑战，但微聚焦光束线同步辐射光源的进步，尤其是冷冻电子显微镜(Cryo-EM)，正在改善数据收集并使蛋白质在近天然状态下可视化。
在缺乏足够真核结构的情况下，分子动力学(MD)模拟模拟原子运动，提供对蛋白质折叠、配体相互作用和转运蛋白动力学的见解，即使在实验未解析结构的情况下也是如此，正如MD对糖苷水解酶中变构刺激的阐明所证明的那样，其中实验结晶未成功。XylE仍然是唯一具有已解析晶体结构的高特异性C5转运蛋白，最近的MD模拟进一步提供了对其结合机制的见解。
展望未来，利用这些先进工具来阐明C5转运蛋白的糖结合机制将为理性设计和工程改造具有增强C5糖摄取的优质酵母菌株提供有价值的见解，推动生物技术应用的进步。
工程酵母平台在2G木质纤维素生物炼制厂中的工业应用
生物技术作为学术创新和工业应用之间的关键接口，特别是在推进木质纤维素生物炼制厂方面。主要工业参与者，如Raízen（巴西）、GranBio（巴西）和Borregaard（挪威），运营基于木质纤维素原料的第二代(2G)乙醇工艺。Raízen和Borregaard报告的年度2G乙醇产量分别为58.8万升和2000万升，而GranBio最近宣布计划通过其Exygen项目达到每年1.6亿升。尽管大部分技术诀窍仍然是专有的，但公开可用的专利申请提供了对这些工业平台背后的菌株工程方法和工艺配置的重要见解。
这些工业过程中的一个共同特征是依赖基因工程酿酒酵母菌株，能够发酵来自半纤维素的戊糖，特别是D-木糖。例如，GranBio采用名为Celere 1的工程酵母菌株，旨在通过木糖异构酶途径发酵木糖，并源自针对改善C5转化的专利菌株平台。同时，Lesaffre的CelluX?菌株系列目前已发展到第四代（CelluX?4），结合了快速木糖消耗和对水解液衍生抑制剂的增加耐受性，解决了2G发酵的关键限制。在整个行业中，工业专利组合始终强调改善戊糖同化、胁迫耐受性和工艺稳健性，突显酵母性能作为木质纤维素乙醇竞争力的重要一步。然而，相对较少的这些专利描述了含有专门设计的糖转运蛋白的菌株，专注于改善木糖摄取和/或消除葡萄糖分解代谢阻遏施加的抑制。在这种情况下，许多这些工业菌株可以通过引入旨在增强木糖摄取并实现更有效混合糖共消耗的C5特异性转运蛋白来潜在地实现进一步的性能提升。
这些工业应用强化了一个实现高效2G乙醇生产的核心原则：成功取决于综合策略，涵盖生物质预处理、酶水解效率以及工程酵母细胞工厂在抑制性工艺条件下消耗木糖并理想地共消耗混合C6/C5糖的代谢能力。
结论与展望
利用木质纤维素生物质生产生物可再生化合物的有效利用需要充分利用所有存在的糖，包括D-木糖和L-阿拉伯糖等戊糖。然而，酿酒酵母在共同利用这些糖与D-葡萄糖方面面临重大挑战，因为其天然转运蛋白对D-葡萄糖表现出更高的亲和力，导致竞争性抑制并限制戊糖的摄取。努力工程改造酿酒酵母菌株以改善糖摄取主要集中在异源表达对D-木糖和L-阿拉伯糖具有更高亲和力的转运蛋白，同时最小化D-葡萄糖抑制。尽管取得了一些进展，这些转运蛋白仍然面临来自D-葡萄糖的竞争性抑制，阻碍了木质纤维素水解液中所有糖的同时摄取。
合成生物学的最新进展，包括蛋白质工程和分子动力学模拟的应用，揭示了糖转运蛋白中对调节糖亲和力和最小化D-葡萄糖抑制至关重要的特定区域。通过靶向这些区域，研究人员已经能够开发出经过修饰的D-木糖转运蛋白，显示出改善的戊糖摄取和减少的D-葡萄糖竞争。这些修饰有望提高工业酵母平台中木质纤维素生物质利用的效率。尽管取得了这些进展，真核转运蛋白中糖转运和结合的精确机制仍不完全清楚。缺乏真核D-木糖和L-阿拉伯糖转运蛋白的晶体结构使得完全阐明潜在的转运动力学具有挑战性。计算方法，如分子对接和动力学，提供了对可能增强转运蛋白性能的结构修饰的见解，但需要进一步的实验验证。酿酒酵母糖转运蛋白工程的未来可能会受益于结构生物学技术的持续进步，例如冷冻电子显微镜，这可以提供对转运蛋白机制的更详细理解。能够高效共利用D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖而没有抑制的菌株的开发将是实现木质纤维素生物质用于生物炼制厂应用全部潜力的关键。
总之，推进酿酒酵母糖转运蛋白工程领域代表着优化酵母平台用于生产生物可再生化合物的重要一步。随着研究的继续，具有改善糖摄取能力的定制转运蛋白的开发将有助于木质纤维素原料的有效转化，支持向可持续生物经济的转变。
