发酵与氧化降解对大豆开菲尔多糖富集提取物组成、抗氧化活性、ACE抑制活性及体外神经保护潜力的影响

《Foods》：Effects of Fermentation and Oxidative Degradation on the Composition, Antioxidant Activity, ACE Inhibitory Activity, and In Vitro Neuroprotective Potential of Soybean-Derived Kefir Polysaccharide-Rich Extracts

　　

开菲尔（Kefir)是一种由共生细菌和酵母菌生产的益生菌饮料。研究人员从黄大豆和黑大豆中获取多糖富集提取物（分别记为S和B），随后经发酵产生S-F和B-F。发酵提取物进一步采用抗坏血酸和过氧化氢进行氧化降解，得到S-FD和B-FD。理化分析显示，S-F、S-FD、B-F和B-FD在组成、酚类物质谱及分子量方面存在显著差异。傅里叶变换红外光谱（FTIR)表明，氧化降解改变了特定官能团的强度，但未破坏多糖的基本骨架结构。发酵增强了血管紧张素转换酶（ACE)抑制活性，随后的氧化降解进一步改善了该效应。发酵和降解提取物均表现出抗氧化活性，包括2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH)和2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS)自由基清除能力、亚铁离子螯合能力及还原力，其中降解样品显示出更强的活性。研究人员在体外评估了提取物对SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的影响。在浓度高达400 μg/mL时未观察到细胞毒性。200 μg/mL处理可提高鱼藤酮（ROT)处理细胞的细胞活力并降低凋亡。多变量分析进一步表明，氧化降解增强了抗氧化和ACE抑制活性，但可能降低在SH-SY5Y细胞中观察到的保护效应。总体而言，大豆来源的开菲尔多糖富集提取物在血压调节和抗氧化活性相关应用中显示出作为功能成分的潜力，而其在神经元细胞模型中的保护效应有待进一步研究。

**研究背景与问题**

开菲尔（Kefir)是一种起源于高加索地区的传统发酵乳制品，因其复杂的微生物生态和多样的生物活性而日益被认可为功能性食品。与传统使用特定 starter cultures 的发酵产品不同，开菲尔是通过乳酸菌、醋酸菌和酵母菌在被称为开菲尔粒的多糖-蛋白基质中的共生作用而产生的。这一动态微生物系统可产生多种代谢物，包括有机酸、乙醇、二氧化碳、胞外多糖（exopolysaccharides, EPS)和生物活性肽。近期研究表明，开菲尔的生物活性与其组成复杂性密切相关，开菲尔来源的胞外多糖可能表现出抗氧化、免疫调节和抗菌活性，并可能有助于调节肠道微生物群和肠道屏障功能。

大豆（Glycine max L.)是营养密集型的原料，富含蛋白质、碳水化合物、膳食纤维、维生素、矿物质和多种植物化学物质。其中，多酚类化合物如黄酮类、酚酸和异黄酮因其抗氧化、降压和降胆固醇活性而广为人知。植物化学成分因基因型而异，特别是种皮颜色：黑大豆比黄大豆含有更高水平的花青素和异黄酮，因而具有更优的抗氧化能力。发酵是增强大豆功能的有效策略，微生物酶可降解大分子并将结合型酚类物质转化为生物可利用形式，增加苷元型异黄酮和总酚含量（TPC)，从而改善抗氧化和抗炎活性，同时降低抗营养因子。

活性氧（ROS)和活性氮（RNS)是细胞代谢不可避免的副产物，过量积累时会诱导氧化应激，导致蛋白质、脂质和DNA损伤。越来越多的证据将氧化应激与高血压联系起来，其中一氧化氮（NO)生物利用度降低、内皮功能障碍以及炎症和氧化还原敏感通路的激活共同导致血管阻力升高。此外，氧化应激通过促进神经炎症、神经元凋亡和蛋白质聚集，在衰老和神经退行性疾病中发挥关键作用。发酵食品，特别是开菲尔，因其抗氧化和抗炎特性而受到关注，这些特性由多样的微生物群落和代谢物介导，可调节肠道微生物群和神经化学信号。然而，传统乳制品开菲尔存在局限性，包括乳糖不耐受、牛奶蛋白过敏和饮食限制，限制了其更广泛的临床应用。因此，植物基开菲尔替代品日益受到关注，豆奶因丰富的营养成分和生物活性物质而成为有前景的培养基质。

**研究目的与意义**

该研究首次系统探究了开菲尔发酵和氧化降解对黄大豆和黑大豆来源多糖富集提取物的理化特性、抗氧化活性、血管紧张素转换酶（ACE)抑制能力及体外神经保护潜力的影响。研究旨在通过整合理化表征、细胞测定和多变量分析，阐明组成变化与生物活性之间的关系。研究结果揭示了氧化降解的双重效应：增强抗氧化和ACE抑制活性的同时，可能降低在神经元细胞中观察到的保护效应。这些发现为开发开菲尔来源的大豆多糖富集提取物作为营养保健品和功能性食品成分提供了新见解。该论文发表在《Foods》。

**关键技术方法**

研究从台湾高雄市当地供应商处获取黄大豆和黑大豆（品种"Tainan 3"），由高雄科技大学DK SHOP提供的含8种菌株的开菲尔发酵剂进行发酵。细胞实验采用ATCC CRL-2266株SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞，来源于台湾食品工业发展研究所。主要技术手段包括：高效液相色谱（HPLC)进行单糖组成测定（配备Inspire C₁₈柱，PMP衍生化)和酚类成分分析；FTIR光谱分析（KBr压片法，4000-400 cm^-1范围)；尺寸排阻色谱（SEC)结合右旋糖酐标准品进行分子量分析；ACE抑制活性测定采用HPLC监测马尿酸释放量；抗氧化活性通过DPPH、ABTS、亚铁离子螯合和铁离子还原能力四种方法评估；细胞活力采用MTT法，凋亡分析采用Annexin V/碘化丙啶（PI)双染流式细胞术；最后运用SPSS软件进行主成分分析（PCA)和Z-score标准化热图分析。

**研究结果**

**分子量、化学组成和单糖组成分析**

SEC分析显示，S-F、S-FD、B-F和B-FD的平均分子量分别为263.6、88.6、232.7和95.2 kDa，氧化降解显著降低了分子量。化学组成方面，总糖含量在发酵和氧化降解后显著降低（S-F: 29.3±0.3%, S-FD: 10.5±1.9%, B-F: 22.5±0.4%, B-FD: 13.8±0.6%)，而还原糖含量在降解样品中显著升高。总酚含量（TPC)和总黄酮含量（TFC)在S-FD和B-FD中显著增加。单糖组成显示，黄大豆组中甘露糖和葡萄糖醛酸为主要单糖，黑大豆组中甘露糖和鼠李糖占主导，氧化降解改变了各单糖的相对比例。

**酚类成分分析**

高效液相色谱分析显示，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG)、香草酸和单宁酸是所有组中的主要酚类化合物。降解增加了黄大豆组的香草酸和尿黑酸含量，以及黑大豆组的EGCG和香草酸含量。这些变化可能与氧化降解过程中多糖基质的破坏有关，从而释放了原本结合或包裹其中的酚类化合物。

**FTIR分析**

FTIR光谱显示，所有样品在约3401 cm^-1（O-H伸缩振动)、2955 cm^-1和2855 cm^-1（C-H伸缩振动)处表现出特征吸收。与发酵样品相比，降解样品在1745 cm^-1（C=O伸缩振动)和1250 cm^-1（C-O-C或C-O-P伸缩振动)处的峰强度发生变化。碳水化合物指纹区（1200-1000 cm^-1)的特征峰（1118、1090和1038 cm^-1)在所有样品中均保持明显，表明核心多糖骨架结构在降解后得以保留。

**抗高血压潜力**

ACE抑制活性测定显示，发酵增强了ACE抑制活性，氧化降解进一步改善了该效应。S-FD的抑制率为88.9±1.6%（与S-F相比p=0.00075)，B-FD达到97.5±0.3%，与阳性对照卡托普利（5 μM)无显著差异（p=0.694)。黑大豆来源的提取物 consistently 表现出比黄大豆更强的活性，这可能与其更高的酚类、黄酮类和花青素含量有关。

**抗氧化活性**

四种抗氧化测定均表明，氧化降解显著增强了抗氧化活性。DPPH自由基清除活性以IC₅₀表示，S-FD（1.12±0.03 mg/mL)和B-FD（1.07±0.02 mg/mL)显著低于S-F（5.60±0.10 mg/mL)和B-F（3.43±0.09 mg/mL)。ABTS^•+清除活性同理，B-FD和S-FD的IC₅₀约为0.075 mg/mL。亚铁离子螯合活性方面，S-FD（1.32±0.01 mg/mL)和B-FD（1.24±0.02 mg/mL)显著优于S-F（7.75±0.12 mg/mL)和B-F（3.83±0.01 mg/mL)。还原力测定显示，在12 mg/mL浓度下，S-FD（1.40±0.06)和B-FD（1.68±0.02)的吸光度值显著高于S-F（0.37±0.00)和B-F（0.34±0.01)。

**SH-SY5Y细胞中的神经保护潜力**

细胞毒性实验显示，0-400 μg/mL浓度范围内细胞活力均高于80%，表明低细胞毒性。据此选择200 μg/mL用于后续神经保护实验。Annexin V/PI双染流式细胞术显示，ROT处理显著降低活细胞比例并增加早期和晚期凋亡细胞比例。S-F预处理明显改善细胞存活，降低凋亡细胞比例，效果优于S-FD。B-F同样表现出保护作用，且效果优于S-F和S-FD。相比之下，B-FD的保护作用弱于B-F。总体而言，氧化降解样品的保护效应低于其对应未降解样品。

**主成分分析（PCA)和Z-score热图分析**

PCA结果显示，PC1解释81.4%的总方差，与还原力、ACE抑制、酚类含量、黄酮类含量和还原糖含量正相关，与分子量和总糖含量负相关。PC2（14.1%)主要反映神经保护潜力。发酵样品（S-F和B-F)与神经保护潜力关联更密切，而降解样品（S-FD和B-FD)与抗氧化活性和ACE抑制关联更强。Z-score标准化热图揭示了类似的聚类模式：降解样品聚为一类，特征为还原糖、总酚、总黄酮、还原力和ACE抑制活性升高；发酵样品聚为另一类，特征为更高分子量和总糖含量，以及更强的神经保护效应。

**讨论与结论总结**

研究结论指出，发酵结合氧化降解有效增强了大豆来源开菲尔多糖富集提取物的生物功能特性。氧化降解显著改善了抗氧化和ACE抑制活性，表明组成修饰在调节开菲尔来源多糖生物活性中起重要作用。黑大豆来源的提取物始终比黄大豆来源的提取物表现出更强的生物活性，突出了原料特性对功能性能的影响。此外，多变量分析揭示了组成特征与生物活性之间的显著关联，为组成与功能之间的关系提供了宝贵见解。

研究承认若干局限性：生物活性仅通过体外测定进行评估，且未鉴定出具体 responsible for 观察到的活性的成分。未来研究应集中于活性多糖组分和肽衍生成分的分离与表征，以及机制研究和体内研究，以进一步验证其功能特性。

总体而言，这些发现为大豆来源开菲尔多糖富集提取物作为食品相关应用中生物活性成分的潜力提供了初步支持。然而，仍需进一步研究以验证这些效果并确定其生理学相关性。