神经退行性疾病中的相分离与蛋白质聚集

《Biophysical Chemistry》：Phase separation and protein aggregation in neurodegenerative diseases

　　霍滕斯·德·拉·塞利耶尔|埃诺拉·莱图尔诺尔|弗朗索瓦·伊查斯|弗朗切斯卡·德·乔治法国波尔多大学，CNRS UMR5293神经退行性疾病研究所SynTeam摘要阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病的特点是淀粉样蛋白聚集，这类蛋白质具有内在无序性，同时还能发生液-液相分离。液-液相分离能够形成对细胞功能至关重要的动态无膜细胞器，可能在限制纤维化进程或防止其在病理条件下异常转变为固体聚集体方面发挥作用。本文综述了突变、翻译后修饰和环境因素如何影响 Tau、TDP-43、FUS 和 α-突触核蛋白等蛋白质的液-液相分离现象，进而调控淀粉样蛋白聚集。我们还探讨了这些蛋白质之间的相互作用，研究液-液相分离和凝聚物成熟如何影响共病的出现，进而推动疾病进展。最后，我们讨论了旨在调控相分离动态的新治疗策略。引言液-液相分离是一种生物物理过程，通过该过程，生物分子混合物会分离成不同的液相，从而在细胞内形成无膜细胞器。与有膜结构的不同，这些无膜细胞器是通过可逆的多价相互作用形成的动态结构，主要涉及蛋白质和核酸。在真核细胞中，已发现数十种此类无膜细胞器，包括核仁、卡哈尔小体、核斑点、副斑点以及应激颗粒。这些细胞器在细胞区室化过程中起着关键作用，同时还参与转录调控、异染色质形成、自噬和应激反应等重要生物学过程。值得注意的是，无膜细胞器的组成是动态的，其状态可因调节因子的存在而改变——这类调节因子通常是能引发翻译后修饰的分子，进而改变系统内的相互作用强度。体外研究表明，液-液相分离对多种生物物理和化学参数十分敏感，比如大分子的浓度和性质（如电荷、疏水性及长度），以及pH值、温度和离子强度等环境条件。例如，较高的盐浓度会干扰静电相互作用，从而抑制相分离。因此，液-液相分离是一种可逆且可调控的现象，受到细胞环境的严格调控，它在细胞中对于应对高度动态的过程具有重要作用。液-液相分离的概念可追溯到1899年，当时威尔逊观察到海胆卵中的细胞液能形成类似乳液的液滴。然而，第一个无膜细胞器的例子出现在1983年，沃尔夫等人通过电子显微镜在秀丽隐杆线虫胚胎中发现了加工P颗粒，斯托姆和伍德则利用荧光显微镜发现了同类结构。一个重大突破是后来有研究证明液-液相分离具有功能性——他们发现RNA和RNA结合蛋白可从早期胚胎中的分散状态转变为浓缩状态，从而形成P颗粒，有助于生殖细胞的特异性形成。这些颗粒表现出类似液-液相分离的特性，包括快速浓缩/溶解以及融合行为。2012年，迈克尔·罗森的团队发现，在细胞骨架组装过程中，多价蛋白质也能发生液-液相分离，形成类液态液滴。大约在同一时间，史蒂文·L·麦奈特及其同事证明，在无细胞系统中，液-液相分离也是RNA颗粒形成的基础。在已知会发生液-液相分离的蛋白质中，内在无序蛋白占比最高。这类蛋白质含有内在无序区域，这些区域常常与低复杂度结构域和朊病毒样结构域重叠。这些区域缺乏稳定的二级或三级结构，而是以高度动态的集合体形式存在，能够进行弱的多价相互作用。这种灵活性使得它们能够与其他蛋白质和生物聚合物发生同型或异型相互作用，因此内在无序区域和低复杂度结构域成为相分离的关键驱动因素。这类蛋白质还能够形成淀粉样纤维，而这正是多种神经退行性疾病的典型病理特征。在阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化症和帕金森病等多种神经退行性疾病中，认知和运动功能衰退都与神经元或其他脑细胞胞质或细胞核中内在无序蛋白的聚集有关。这类疾病统称为蛋白病或聚集病，其特征均为淀粉样蛋白聚集，无论疾病是偶发性的还是遗传性的，都表明聚集过程是共同的致病机制。虽然液-液相分离过程中的蛋白质相互作用极为动态，但淀粉样蛋白则是具有特定热力学稳定结构的蛋白质聚集体，能够形成纤维。 “淀粉样蛋白”这一术语最初由施莱登提出，用于描述植物中的类淀粉成分，后来维尔肖将其推广，用来描述他在一名104岁痴呆症女性大脑中观察到的碘染色沉积物。尽管后来人们发现这些沉积物是由有序排列的蛋白质纤维构成的，但“淀粉样蛋白”这一术语依然沿用至今。在分子层面，淀粉样纤维是一种长而细的结构，直径约为10纳米，长度可达数微米。淀粉样蛋白的特征结构为交叉β折叠结构，其中单个蛋白质采取与纤维轴垂直排列的β链构象，这些β链会堆叠形成β折叠片层，通过分子间氢键相互稳定，从而构成纤维轴。单个堆叠结构被称为原丝，它们可以螺旋式交织，形成成熟的纤维。1982年，斯坦利·普鲁西纳提出了朊病毒假说，认为后来被命名为朊病毒的淀粉样结构可能作为传染性因子，能够传播羊的致命神经退行性疾病——痒病。虽然有一些淀粉样蛋白被认为具有支持生理功能的作用，但普鲁西纳的研究引发了科学界对淀粉样蛋白在神经退行性疾病中更广泛作用的极大兴趣。他通过展示自我复制的蛋白质聚合体概念——这一概念早先由彭罗斯通过机械模型提出——为将朊病毒类似机制视为阿尔茨海默病和帕金森病病情进展的主要驱动因素奠定了基础。他的研究为理解蛋白质错误折叠如何在多种蛋白病中扩散提供了思路，这一现象也与这些疾病的渐进性特征相符。淀粉样蛋白聚集过程通常分为两个阶段：成核，即初始种子的形成；延伸，即单体在该种子上的逐步聚集。在延伸阶段，处于内在无序蛋白状态的游离单体与已形成的核心接触，改变构象以匹配β折叠结构，然后逐渐融入纤维中，促进纤维的生长。根据朊病毒类似假说，这种有种子引导的聚集过程有助于病理学的扩散和进展，这一现象在体外和体内的生物模型中都有充分记载。在细胞环境和病理模型中，聚集过程的初始阶段——即成核阶段——的研究相对较少，尽管它是聚集过程的关键步骤。有研究认为，由于内在无序蛋白具有内在的构象灵活性和动态特性，不稳定的单体蛋白可以暂时呈现中间构象——通常称为寡聚体——这类构象有助于成核，随后进一步发展成淀粉样纤维。不过，内在无序蛋白的相同生物物理特性也有利于液-液相分离，因此，纤维也可能在密集蛋白质凝聚物发生液-固相转变之后才出现。从2015年开始，研究人员开始将液-液相分离与人类疾病，尤其是神经退行性疾病联系起来，建立了相分离蛋白与病理聚集之间的关联。简化的解释是，液-液相分离会创造一个高浓度的蛋白质环境，使蛋白质单体彼此靠近，从而达到相转变所需的阈值，进而促进淀粉样蛋白的形成。因此，液-液相分离环境可能通过增加从液-液相分离状态向不可逆的液-固状态转变的概率来推动蛋白质聚集，最终形成淀粉样蛋白（见图1）。不过，液-液相分离与淀粉样蛋白转化之间的关系可能更为复杂，甚至可能存在竞争关系。仅考虑关键的生物物理参数，如蛋白质浓度以及各种蛋白质状态——单体、凝聚物、寡聚体和纤维——的时间演变，或许就足以解释文献中报告的矛盾现象，包括促进和抑制纤维化以及双相效应。与此一致的是，近期的一些研究通过考虑在蛋白质浓度较低和较高的环境中寡聚化和纤维化的情况，提出了一种新模型，该模型能够再现与浓度无关的聚集动力学，从而为解释液-液相分离如何加速或抑制纤维形成提供了生物物理依据。此外，关于纤维形成这一方面，学界的研究正在超越那种认为液-液相分离仅仅会增加局部蛋白质浓度的简单观点，转而采用更为细致的看法，即凝聚物中的成核过程在空间上是非均匀的。越来越多的证据表明，淀粉样蛋白的成核更可能发生在生物分子凝聚物的界面处，而非整个密集相中均匀分布。这类界面具有独特的物理化学环境，特征包括分子拥挤、各向异性相互作用以及蛋白质构象的改变，所有这些因素都可能有利于易聚集物种的形成。在多种具有相分离能力的蛋白质中都观察到了这种现象，包括FUS、hnRNPA1和p62，这些蛋白质的凝聚物表面似乎可作为催化位点，促进从动态聚合体向更稳定的类淀粉样聚集体转变。最后还需要指出的是，在细胞环境中，液-液相分离结构是由多种蛋白质组成的，这又增加了复杂性。基于以上原因，除了在调节生理过程中的作用外，液-液相分离现在也被认为是多种神经退行性疾病发病机制中的关键环节。在本篇综述中，我们研究了三种神经退行性疾病的案例，分析了相应疾病相关蛋白质的相分离特性。我们探讨了将液-液相分离与这些神经元蛋白病及其实验模型中的淀粉样蛋白转化联系起来的证据，旨在将这些蛋白质的液-液相分离生物物理特征与其在疾病发病机制中的作用联系起来。肌萎缩侧索硬化症是一种进行性神经退行性疾病，其特征是运动神经元选择性丢失，从而导致肌肉无力和瘫痪。该疾病的典型病理特征是存在由定位异常的RNA结合蛋白构成的细胞质包涵体，这类蛋白包括TAR DNA结合蛋白43、融合肉瘤基因产物FUS以及异核核糖核蛋白A1。这些蛋白质是RNA代谢的重要调节因子，尤其是在神经元中的RNA剪接过程中发挥作用。它们具有共同的结构特征，包括内在无序区域和朊病毒样结构域，这些结构特征使得它们能够发生液-液相分离。在生理条件下，TDP-43、FUS和hnRNPA1参与形成应激颗粒和RNA运输颗粒等无膜细胞器，从而动态调节RNA剪接、代谢和翻译过程。液-液相分离使得这些蛋白质能够在细胞应激时凝结成类液态液滴，形成可逆的细胞区室，保护RNA并协调其加工过程。因此，液-液相分离可被视为这些蛋白质发挥功能时的生理性结合形式。然而，在病理条件下，通常定位于神经元和胶质细胞细胞核内的FUS和TDP-43会移位到细胞质中，形成淀粉样纤维。FUS由三个主要结构域组成：包含朊病毒样结构域的N端区域、中央的RNA识别基序，以及含有锌指结构的C端区域。这三个区域都含有RG/RGG富集结构域，而该蛋白质的核定位则由核定位信号维持。在肌萎缩侧索硬化症中，大多数突变发生在核定位信号区域内，从而破坏了细胞核与细胞质之间的平衡。FUS的朊病毒样结构域既能引发同型和异型液-液相分离，又能形成淀粉样聚集体，而该结构域的截短则会抑制淀粉样纤维的形成。因此，在FUS中，朊病毒样结构域既参与了淀粉样聚集的形成，也参与了液-液相分离过程，这说明这两种过程的分子决定因素在该蛋白质中存在重叠。不过，这种重叠并非所有蛋白质都必须具备。此外，精氨酸甲基化会干扰液-液相分离并抑制淀粉样纤维的形成。有趣的是，HSP40辅助伴侣蛋白DNAJB6可以通过促进FUS凝聚物的“松散凝胶化”来阻止其向FUS纤维的转化。TDP-43由N端结构域、两个RNA识别基序结构域以及C端的朊病毒样结构域组成。所有这些结构域都会影响TDP-43的液-液相分离倾向。在朊病毒样结构域内部，存在一段含有短暂α螺旋的区域，该区域具有内在无序性，且在液-液相分离过程中起着关键作用。Conicella等人发现，在TDP-43的同型相互作用过程中，该区域的螺旋倾向会增加，且该区域的突变会促进其在体外从液态向固态的转变（图2B）。Lin等人进一步证实，PrLD内的甲硫氨酸氧化会导致液滴溶解，而甲硫氨酸亚砜还原酶可以逆转这一过程[59]。TDP-43的N端结构域也会影响LLPS现象，因为一种磷酸模拟突变（S48E）被证明会抑制TDP-43在体外的相分离和寡聚化过程[60]。多聚(ADP-核糖)（PAR）是一种带负电荷的生物聚合物，由PAR聚合酶（PARPs）合成，并在翻译后修饰过程中共价结合到含有Glu、Asp、Lys、Arg或Ser残基的蛋白质上[61]；Y.[62]。PAR化作用在DNA修复、转录调控以及细胞死亡过程中发挥作用，同时还能调节应激颗粒的动态变化。Duan等人表明，PAR化程度降低会阻碍应激颗粒的形成以及TDP-43的聚集，而PAR化程度升高则能恢复这些过程[63]。TDP-43的NLS区域含有一个PAR结合位点，使得PAR能够促进其相分离以及应激颗粒中的定位。虽然这种机制最初可以通过将TDP-43困在应激颗粒中来防止病理性聚集，但如果应激颗粒的解聚功能出现障碍，就可能会引发不可逆的聚集现象（图3）。无论是TDP-43还是FUS，对于在细胞应激作用下形成应激颗粒都至关重要，这类应激会干扰翻译和核质运输等关键生理过程。应激颗粒的形成是一种保护机制，它能暂时停止mRNA的翻译，避免其被降解[64]。不过，适当的应激颗粒解聚对于细胞的恢复十分重要，而在肌萎缩侧索硬化症中，这一过程的异常可能就会导致病理性聚集（图3）。支持这一观点的是，在肌萎缩侧索硬化症中，应激颗粒常常与病理性包涵体共定位[65]。除了这些RNA结合蛋白在肌萎缩侧索硬化症中发生错误折叠和聚集外，LLPS介导的机制也可能在超氧化物歧化酶1以及含有重复序列的RNA的病理性聚集过程中起作用。在通过LLPS形成的应激颗粒中，已经观察到了错误折叠的SOD1[66]、[67]、[68]。有趣的是，肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆最常见的遗传病因是C9ORF72基因中的六核苷酸（GGGGCC）重复序列扩增，这类扩增会通过与LLPS相关的机制引发神经毒性（Raguseo等人，2023年）。综上所述，在肌萎缩侧索硬化症中，LLPS及凝聚态动态的紊乱似乎是导致病理性聚集产生的主要机制。因此，弄清肌萎缩侧索硬化症相关蛋白质/RNA中LLPS的生物物理机制，对于开发出能够预防或逆转病理性蛋白质聚集的针对性策略而言至关重要。与此相关的是，Jiang等人报告称，单次使用针对重复序列RNA的反义寡核苷酸就能显著减少RNA聚集灶以及二肽重复蛋白，进而改善患者的行为表现（J. [69]）。在2020年的一项临床试验中，针对SOD1 mRNA设计的反义寡核苷酸托非森（见表1），在鞘内给药12周后，不仅降低了脑脊液中的SOD1水平[87]，还降低了血浆中的神经丝轻链含量，而后者是轴突损伤和神经退行性变的标志物（VALOR，ClinicalTrials.gov编号NCT02623699）。托非森（QALSODY）现已成为首个获批用于治疗肌萎缩侧索硬化症的基因靶向疗法。需要指出的是，除了肌萎缩侧索硬化症之外，TDP-43和FUS的病理性聚集也是近一半额颞叶痴呆病例的致病因素[90]；在这一背景下，新型的超短RNA分子伴侣或许也能成为逆转肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆中TDP-43凝聚态的有效手段[89]。微管相关蛋白Tau在多种疾病中都会发生聚集，从而导致大脑中出现难以溶解的细胞质包涵体，这类疾病统称为tau蛋白病，包括阿尔茨海默病、近一半的额颞叶痴呆病例以及进行性核上性麻痹[91]、[92]。Tau是一种固有无序蛋白，在人类大脑中存在六种亚型，由于特定外显子的可变剪接，这些亚型在初级序列上存在差异（图4）[94]，并且它们在不同tau蛋白病中的作用也各不相同[95]。不同亚型在电荷分布和重复序列含量上的差异会影响Tau发生LLPS的能力，其中4R亚型通常表现出更强的凝聚和聚集倾向，这表明LLPS易感性与病理转化之间存在直接关联。最初证明Tau具有LLPS能力的实验中使用的是在昆虫细胞中表达的磷酸化形式的Tau蛋白（p-Tau441），实验结果显示，在存在分子拥挤剂的情况下，它能够形成液滴[96]、[97]。Wegmann等人提出，磷酸化是通过静电作用和疏水作用之间的复杂相互作用来驱动Tau发生LLPS的关键因素。然而后续研究却发现，细菌表达的（未磷酸化的）Tau在某些生理条件下同样具备LLPS能力。具体而言，在生理pH值下，Tau的负电荷N端结构域与带正电荷的中央及C端区域之间的分子间静电吸引会推动LLPS的发生[98]。除了同型LLPS之外，Tau还能够与RNA形成异型凝聚物。多项研究表明，Tau在RNA存在的情况下也会发生LLPS，当Tau与RNA的比例约为1:1时，凝聚效果最佳（X. [99]）。Najafi的研究表明，提高盐浓度会降低凝聚程度，这进一步证明了静电相互作用是驱动LLPS的主要力量[100]。虽然Tau与RNA的相互作用似乎占主导地位，但根据RNA浓度的不同，Tau与Tau之间的相互作用也可能起到一定作用。不同研究中所发现的与Tau相互作用的RNA类型也各不相同。最初的研究显示，Tau更倾向于与tRNA结合（X. [99]）。后来，Lester等人发现，聚集状态的Tau更倾向于与小的核RNA和核仁RNA结合[101]。Jiang等人进一步表明，细胞质中的寡聚态Tau会直接或通过与N6-甲基腺苷（m6A）修饰的转录本结合，从而与这类转录本发生相互作用（L. [102]）。综合这些研究结果可以看出，RNA在调节Tau的LLPS过程中起着核心作用，而这很可能对疾病状态下的基因表达产生重要影响。不过，Tau和RNA也可在应激颗粒中通过RNA结合蛋白TIA-1发生相互作用，这种蛋白能够促进应激颗粒的形成。在这种情境下，TIA-1可以与Tau结合，进而促使Tau聚集，最终导致与疾病相关的Tau介导的毒性作用和神经退行性变化（图5）[104]。此外，Tau在tau蛋白病中还会经历多种翻译后修饰。这些修饰会改变Tau的电荷、构象以及与其他大分子的相互作用，进而可能影响其相行为。如前所述，磷酸化是研究最为广泛的Tau翻译后修饰，也被视为病理性聚集的典型特征。多项研究表明，磷酸模拟替代基团会增强Tau的LLPS能力[97]、[105]、[106]。尤其是Wegmann及其同事证实，Tau的过度磷酸化会促使Tau液滴成熟为更接近凝胶状态的液态到固态相分离结构。另一种重要的翻译后修饰是赖氨酸残基的乙酰化，这种修饰会中和正电荷，可能破坏凝聚过程所必需的关键静电相互作用。事实上，Ukmar-Godec等人的研究也表明，乙酰化会降低Tau发生LLPS的倾向[107]、[108]。Tau的相转变在生理过程中可能发挥着重要作用。例如，已知Tau的LLPS可通过其与微管蛋白的相互作用来促进微管的聚合（图5）[96]。不过，这类环境被认为只是通往病理性聚集和淀粉样纤维形成的中间阶段。为了说明LLPS与淀粉样蛋白转化之间的关系在细胞环境中可能十分复杂——同时也凸显出在针对这一过程研发治疗策略时需要格外谨慎——我们可以以亚甲蓝为例（见表1），这是一种长期以来因具有抑制Tau聚集的作用而被研究作为潜在的针对Tau的疗法的分子[78]。2023年，Huang及其同事研究了亚甲蓝对Tau LLPS的影响，结果发现亚甲蓝反而会促进Tau液滴的形成，并加速其从液态向固态的相转变[79]。这一效应是由亚甲蓝与Tau之间的疏水作用和静电相互作用驱动的，而且与亚甲蓝此前被认为具有抑制Tau淀粉样蛋白聚集的氧化还原活性无关。此外，在同一项研究中，亚甲蓝还被证明可以通过诱导凝胶化作用来阻止Tau液滴转化为淀粉样纤维，同时还能降低Tau聚集体的细胞毒性。尽管凝胶化会降低Tau和微管蛋白的移动性，但它并不会妨碍 Tau液滴内部的微管组装。α-突触核蛋白是一种突触前蛋白，对突触传递起着至关重要的作用。这种14 kDa大小的蛋白属于固有无序蛋白，这一特性使其能够发生寡聚化并形成淀粉样纤维。α-突触核蛋白的淀粉样聚集是一类被称为突触核蛋白病的神经退行性疾病的共同特征，这类疾病包括帕金森病、路易体痴呆以及多系统萎缩症。这三种疾病的所有病例中，神经元内都会出现磷酸化后的α-突触核蛋白（位于Ser129位点）形成的淀粉样包涵体，而在多系统萎缩症患者中，少突胶质细胞中也会出现此类包涵体。α-突触核蛋白由三个主要结构域组成：带正电荷的N端结构域，该结构域含有不完整的KTKEGV重复序列，这些序列负责介导与膜的结合，同时在与脂质相互作用时有助于蛋白呈现α螺旋构象；高度疏水的中央非淀粉样β成分区域（NAC），该区域构成了易于聚集的核心部分[109]；最后是富含酸性残基的C端结构域，这一结构域保持高度灵活性，能够通过与金属离子、其他蛋白质以及翻译后修饰的相互作用来调控淀粉样纤维的形成（图6）。与上述其他蛋白不同，目前尚未在神经元中发现与LLPS相转变相关的功能作用，不过在受控的体外实验条件下，已经充分证明了α-突触核蛋白具有发生LLPS的倾向[110]。Mahapatra等人的研究发现，通过化学手段引入一些细微的点突变，增加LCD序列的复杂性，能够降低α-突触核蛋白发生LLPS的倾向，这说明序列复杂性与相分离之间存在负相关关系[111]。在体外的生理条件下，α-突触核蛋白的溶解度很高，不会发生LLPS。但在低盐浓度环境下，α-突触核蛋白会采取一种自我抑制的构象，此时带负电荷的C端区域与带正电荷的N端区域之间会产生长距离的静电相互作用，从而遮蔽NAC区域，进而阻止分子间相互作用以及淀粉样聚集的发生。相反，高盐浓度或高浓度对抗离子则可以屏蔽这些末端电荷，导致NAC区域暴露出来，进而引发α-突触核蛋白的LLPS现象（图6）[112]。如前文所述，带负电荷的C端结构域通过与带正电荷的分子之间的静电相互作用，对α-突触核蛋白的相分离起着调控作用。有研究表明，精胺和钙离子会加速液滴的形成，这一结果与其他研究结论一致，即Ca2+和Mn2+能够促进α-突触核蛋白的LLPS过程[112]、[113]。翻译后修饰以及与疾病相关的突变会显著影响α-突触核蛋白的相分离。例如，与家族性帕金森病相关的E46K和A53T突变（图6）会同时增强α-突触核蛋白的LLPS反应及其向固态的转变[110]。其他与帕金森病相关的突变，如A30P、G51D和A53E（图6），这些突变与早发性帕金森病相关，其聚集动力学较慢，目前在这一领域的研究还相对较少[114]、[115]；J. [116]。在各类翻译后修饰中，突触核蛋白病中最常见的是Ser129位的磷酸化作用（图6）。在该位点进行磷酸模拟替代后，会加速α-突触核蛋白的相分离过程（图6）[112]。所有这些因素在体外实验中都被证明会促进淀粉样聚集，而且众所周知，它们会加重人类和动物模型中的疾病进展[117]；J. [118]。Sawner等人的研究表明，α-突触核蛋白在酸性pH值环境下（例如pH 5.5）也能发生LLPS现象[112]，这样的环境类似于溶酶体的内部环境，而已知α-突触核蛋白会在溶酶体中被降解。值得注意的是，还有其他研究显示，α-突触核蛋白在溶酶体中的构象与其在细胞质中的构象存在明显差异[119]、[120]。这种构象变化或许能为溶酶体内的相分离提供一种独特但尚未被充分研究的机制。最终，α-突触核蛋白形成液滴状的相分离状态，很可能会导致其固化并形成淀粉样纤维。Ray等人利用荧光寿命成像技术和傅里叶变换红外显微镜技术，发现α-突触核蛋白的固化是按空间和时间顺序发生的，首先从液滴的核心部位开始，然后逐渐向外扩展（图7）[121]。这很可能是由于凝聚物的核心区域与边缘区域的分子环境存在差异所致。Agarwal等人通过实验证明了α-突触核蛋白在细胞内部确实可能发生LLPS现象，他们在细胞模型中观察到，当α-突触核蛋白与其已知的相互作用伙伴——SNARE蛋白VAMP2共同表达时，就会引发α-突触核蛋白的相分离现象[122]。另一个能够调控α-突触核蛋白LLPS过程的因子是β-突触核蛋白，它是突触核蛋白家族中的同源成员，在大脑中会与α-突触核蛋白共定位[123]。与αSyn类似，βSyn也是内在无序结构，但其NAC结构域缺少11个氨基酸残基，因此不易聚集[124]。最新研究表明，βSyn通过抑制液滴融合来负向调节αSyn凝聚物的成熟，这表明它在调控αSyn淀粉样蛋白聚集以及相关的突触核蛋白病方面可能具有保护作用[71]。此外，人们还研究了PARP1（多聚ADP-核糖聚合酶1）在αSyn相关神经退行性疾病中的作用。有研究显示，合成的αSyn预形成纤维可通过激活PARP1介导的细胞死亡途径，在体外和体内诱发神经元死亡，这一过程被称为“parthanatos”[125]。值得注意的是，敲除或抑制PARP1能够防止由PFF注射引起的神经退行性变和行为缺陷。由于已知PARylation会促进蛋白质中的LLPS形成[63]，因此有假设认为αSyn可能会发生PARylation，进而引发LLPS和淀粉样蛋白聚集（见图7），而这又可能进一步加剧PARP1的激活。实际上，PD患者的黑质和脑脊液中PARP1水平确实有所升高[125]。综上所述，αSyn的相分离可能是该疾病病理过程中的关键步骤，它在单体向病理性淀粉样蛋白转化的过程中起着重要作用，但目前仍缺乏直接证据表明其在成核阶段或限制类似朊病毒的扩散方面发挥作用。那么，针对αSyn的相分离是否有可能成为限制突触核蛋白病中淀粉样蛋白形成的潜在治疗策略呢？例如，可以促进β-突触核蛋白（βSyn）的作用，因为后者已被证实是αSyn LLPS的自然调节因子（见表1）。与此一致的是，Hardenberg等人证明，αSyn液滴可以通过与模拟突触囊泡的脂质体融合而稳定下来，从而避免其异常成熟为固体聚集体[70]。由于淀粉样蛋白的成核可能发生在生物分子凝聚体的界面处[48]、[49]、[126]，这为调控聚集提供了新的思路。例如，2025年Visser的研究表明，当使用低浓度的核苷三磷酸或短寡核苷酸降低凝聚体界面的电荷时，若将αSyn从凝聚体界面移除，其聚集速度就会减慢[74]。我们讨论了三种与能够发生相分离及淀粉样蛋白聚集相关的疾病。虽然很难在体内进行验证，但有人认为，异常的凝聚体形成或不当的凝聚体老化最终可能导致淀粉样蛋白包涵体的出现，而这些包涵体随后可能通过类似朊病毒的机制传播。通常情况下，每种疾病都与某种主要蛋白质的聚集有关，这种蛋白质通过引发聚集并使其扩散来推动疾病的进展。然而，这是一种简化的观点，该模型并不能准确反映患者大脑中的复杂情况。事实上，在30%到75%的病例中——具体比例取决于疾病类型——可同时发现多种蛋白质的聚集体。这类病例被称为共病。共病的发生可能与LLPS的失调有关，从而导致多种异质性相互作用[127]。

片段内容：tau蛋白与α-突触核蛋白
tau蛋白与αSyn的共病较为常见，大约80%的神经退行性痴呆症都存在含有这两种蛋白质的病理性包涵体[128]。例如，约50%的阿尔茨海默病患者除了存在tau蛋白相关病变外，还会出现αSyn聚集体，如路易小体[129]。已有研究表明，tau蛋白与αSyn可直接相互作用，具体是通过αSyn的C端结构域与tau蛋白的富含脯氨酸区域2（PRR2）实现相互作用（见图4、图6）[130]。

TDP-43与α-突触核蛋白
另一种常见的共病涉及TDP-43和αSyn。有研究显示，19%的伴有痴呆症的帕金森病患者也存在TDP-43聚集体[132]。αSyn可通过其类似朊病毒的结构域（PrLD）与TDP-43相互作用，从而形成异质性的淀粉样蛋白聚集体[133]。一个关键问题是，处于应激颗粒内的胞质αSyn——无论是单体形式还是淀粉样蛋白形式——是否能够与TDP-43发生相互作用。Dhakal等人对这一问题进行了研究，得出了相应结论。

TDP-43与tau蛋白
tau蛋白与TDP-43的共病是研究最为广泛的共病之一，超过60%的阿尔茨海默病患者存在此类共病[136]、[137]。阿尔茨海默病中TDP-43病变的存在与更严重的神经退行性变、更严重的功能损害以及更为明显的认知功能下降相关[138]。多项研究表明，tau蛋白与TDP-43会在患者大脑中共同聚集，这表明这两种蛋白质之间存在直接相互作用[139]。体外实验也证实了这一点。

结论
近年来，液-液相分离现象被视作一种统一的生物物理机制，它既有助于生理性无膜细胞器的形成，也与神经退行性疾病中所出现的病理性聚集体形成有关。正如本综述所阐述的，LLPS对多种内在无序蛋白质的行为具有重要影响，这些蛋白质包括tau蛋白、TDP-43、FUS以及αSyn，它们各自都与不同的、但又有重叠的神经退行性疾病相关。

CRediT作者贡献说明
Hortense de La Seiglière：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写。
?nora Letourneur：写作——初稿撰写。
Fran?ois Ichas：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写。
Francesca De Giorgi：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写。

利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本文研究成果的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了法国国家研究署（资助项目编号为ANR-22-CE16-0002和ANR-24-CE93-0003）以及医学研究基金会的支持，后者的资助项目编号为MND202411019711。