《Biosensors and Bioelectronics》：Multiplexed Plasmon-enhanced Lateral Flow Assay for Early Diagnosis of Acute Kidney Injury
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急性肾损伤（AKI）的早期诊断仍是一项重大临床挑战，原因在于常规标志物如血清肌酐（SCr）存在延迟性和敏感性不足等问题。尿液蛋白生物标志物，包括中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）和胱抑素C（CysC），可提供更为即时的肾脏损伤补充信息，但其临床转化受
急性肾损伤（AKI）的早期诊断仍是一项重大临床挑战，原因在于常规标志物如血清肌酐（SCr）存在延迟性和敏感性不足等问题。尿液蛋白生物标志物，包括中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）和胱抑素C（CysC），可提供更为即时的肾脏损伤补充信息，但其临床转化受限于缺乏快速、定量且能进行多重检测的即时检测（POC）诊断方法。本研究开发了一种基于等离激元荧光纳米标记的多重侧向流层析技术（p-LFA），可实现NGAL和CysC的灵敏、定量及同步检测。通过利用超亮等离激元荧光纳米标记和比率荧光分析策略，该p-LFA系统可达到皮克每毫升级别的分析灵敏度，与酶联免疫吸附测定法（ELISA）相当。此外，简化的检测流程可将样本到读数时间缩短至10分钟，同时保持足以实现准确AKI检测的灵敏度。利用儿科尿液样本进行的临床验证显示，两种生物标志物检测结果与ELISA测量值均具有良好的相关性。NGAL和CysC的联合分析显著提高了AKI的诊断性能，在研究队列中实现了0.973的受试者工作特征曲线下面积（AUC），临床灵敏度为90.9%，特异性为91.2%。此外，一种低成本便携式荧光读数仪可实现与台式成像设备相当的定量性能，同时显著降低了仪器成本和操作复杂度。该研究建立了一种可扩展且适应性强的p-LFA平台，在实验室级别免疫分析和实用化POC诊断之间架起了桥梁，为去中心化医疗环境中的早期AKI检测和多重生物标志物分析提供了有前景的解决方案。
急性肾损伤（AKI）是一种常见且严重的临床状况，可影响高达30%-50%的危重患者，尤其是重症监护病房（ICU）收治的患者，其发病率和死亡率均显著增加，住院时间延长，且慢性肾脏病风险升高。尽管AKI具有重要的临床意义，但其早期诊断仍面临挑战。当前临床实践主要依赖血清肌酐（SCr）和尿量的变化，这些指标具有延迟性、间接性和敏感性不足的特点，导致早期干预时机经常被错失，因此迫切需要快速、灵敏且具备临床可操作性的AKI诊断工具。
近年来，尿液蛋白生物标志物如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）和胱抑素C（CysC）已成为有前景的肾脏损伤早期指标。NGAL在肾小管损伤后迅速上调并释放至尿液和血液中，而尿CysC则反映近端肾小管功能障碍，与NGAL提供互补信息。然而，这些生物标志物向常规临床应用的转化受到限制，原因在于缺乏能够同时实现高灵敏度、定量准确性、多重检测能力和快速周转的即时检测（POC）平台。
侧向流层析技术（LFA）因其成本低、使用简便且对基础设施要求低，被广泛用于POC诊断。传统LFA主要依赖比色金纳米颗粒标记，但其固有的光学信号强度有限，这制约了分析灵敏度，并对定量分析和低丰度蛋白生物标志物的检测构成显著挑战。等离激元荧光纳米标记（PF）作为一种新兴策略，通过将分子荧光团与等离激元纳米结构偶联，利用等离激元增强的激发和发射实现强荧光放大，从而提升LFA的分析灵敏度。等离激元增强荧光源于两种主要机制：激发增强和辐射衰变速率增强。金属纳米结构中的局域表面等离激元共振（LSPR）产生强化的近场电磁场，提高荧光团激发效率；同时荧光团偶极子与等离激元模式的耦合增强辐射衰变速率和荧光发射。前期研究表明，PF纳米标记可在比传统基于金纳米颗粒的比色检测所需密度低约四个数量级的条件下产生可检测的荧光信号。
本研究旨在开发一种基于等离激元荧光的多重侧向流层析技术（p-LFA），用于AKI生物标志物的快速、定量和POC检测。研究人员选取NGAL和CysC作为目标分析物以提高AKI早期发作时的诊断准确性。通过整合超亮PF纳米标记和比率荧光读数（定义为测试线与对照线荧光强度之比），该p-LFA能够在临床相关浓度范围内对NGAL和CysC进行灵敏且多重化的检测。
样本来源方面，研究人员使用从患者收集的儿科尿液样本进行临床验证，样本通过导尿管在器官衰竭发作后24小时内采集，包括呼吸衰竭、循环衰竭和/或休克患者。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：合成银包覆金纳米棒（AuNR@Ag）作为等离激元核心结构，其LSPR波长约800 nm，与800CW荧光染料的激发和发射波长相匹配；通过硅氧烷共聚物间隔层调控荧光团与金属表面的最优间距以最小化金属诱导的猝灭；采用生物素-链霉亲和素偶联策略制备检测抗体-PF800偶联物（dAb-PF800）；构建含集成样本/结合垫的p-LFA结构，或采用半条膜直接加样格式；利用785 nm激发/820 nm发射通道进行荧光成像；建立比率荧光分析策略，以测试线与对照线荧光强度之比进行定量；采用五参数逻辑斯蒂模型拟合标准曲线并计算检出限（LOD）和定量限（LOQ）；运用受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断性能。
研究结果部分，研究人员首先完成了多重p-LFA的设计与构建。该装置包含集成样本/结合垫、具有空间分离的NGAL和CysC测试线及对照线的硝酸纤维素（NC）膜、以及吸收垫。PF纳米标记通过将分子荧光团与等离激元纳米结构偶联实现强荧光放大。抗体偶联的PF纳米标记经 previously reported protocol 制备，以AuNR@Ag为核心，经800CW染料和检测抗体修饰后获得dAb-PF800偶联物。生物共轭后纵向LSPR峰发生红移，但峰的对称性和半峰宽保持不变，表明纳米颗粒未发生聚集。荧光强度比较显示抗体偶联后荧光强度降低约15%，但不影响整体增强效果。透射电镜（TEM）证实dAb-PF800偶联物形态均一、尺寸分布窄，平均长度114.8±12.5 nm，宽度38.4±3.6 nm，银包覆厚度12.8±1.2 nm。
接着，研究人员完成了NGAL单重半条p-LFA的定量检测优化。该配置仅含NC膜和吸收垫，可直接引入预混的分析物和检测纳米标记。NGAL捕获抗体和抗山羊IgG分别印制形成测试线和对照线，间距4 mm。通过优化捕获抗体浓度，发现2 mg/mL时性能最优，基于绝对荧光分析的LOD为6.2 pg/mL，LOQ为12 pg/mL；基于比率荧光分析的LOD为4.6 pg/mL，LOQ为7.6 pg/mL，相对误差（RE）13.9%，变异系数（CV）8.4%，满足≤20%的接受标准。标准ELISA的LOD为4.2 pg/mL，LOQ为4.9 pg/mL，两者分析性能相当。
进而，研究人员开发了含集成样本/结合垫的p-LFA以简化操作并缩短样本到读数时间。该设计中dAb-PF800偶联物预先固定于结合垫，样本引入后释放并在层析过程中形成免疫复合物。30分钟检测时间的绝对荧光分析LOD为85 pg/mL，LOQ为0.18 ng/mL；比率荧光分析LOD为32 pg/mL，LOQ为33 pg/mL。缩短至10分钟时，绝对荧光LOD为0.35 ng/mL，LOQ为1.4 ng/mL；比率荧光LOD为0.18 ng/mL，LOQ为1.2 ng/mL，仍远低于临床截断浓度50–500 ng/mL。与比色金纳米球（AuNS）LFA相比，PF-LFA的LOQ低约两个数量级。
随后，研究人员评估了多重p-LFA中的交叉反应性。在同一NC膜上设置空间分离的NGAL和CysC测试线，间距4 mm，有效宽度各约1 mm。用单分析物样本挑战含两种检测抗体偶联物的多重体系，结果显示NGAL仅在其测试线产生浓度依赖性荧光增强，CysC测试线无响应；反之亦然。单重和多重格式在1 ng/mL NGAL时的差异小于2%。NGAL在多重格式中的LOD为80 pg/mL，LOQ为0.10 ng/mL，RE 11.3%，CV 3.9%；CysC的LOD为0.14 ng/mL，LOQ为0.27 ng/mL，RE 11.3%，CV 8.5%。不同宽度ROI（1.0、1.5、2.0 mm）的定量结果一致，证实信号均匀性良好。
之后，研究人员利用多重p-LFA进行AKI诊断验证。多重格式中NGAL的LOD为0.12 ng/mL，LOQ为0.30 ng/mL；CysC为52 pg/mL和91 pg/mL。对45例儿科患者尿液样本（器官衰竭发作24小时内采集，11例AKI阳性，占24.4%）进行分析，与ELISA的Pearson相关系数（r）分别为0.980（NGAL）和0.984（CysC）。延长NGAL浓度范围观察到信号饱和但无高剂量钩状效应，稀释回收率86.1%–111.3%。ROC分析显示，单独NGAL的AUC为0.939（95%CI：0.836–1），截断值333 ng/mL；单独CysC的AUC为0.818（95%CI：0.655–0.981），截断值702 ng/mL。联合NGAL和CysC的AUC达0.973（95%CI：0.905–1），灵敏度90.9%，特异性91.2%。基于ELISA的联合分析AUC为0.979（95%CI：0.917–1），灵敏度特异性相同。
最后，研究人员评估了便携式荧光读数仪的POC适用性。该读数仪尺寸21.5×16.3×14.7 cm，重量2 kg，集成触摸屏，约3秒出结果，电池续航12小时，规模化成本约200美元。代表性荧光图像清晰分辨对照线和两条测试线。NGAL基于比率荧光的LOD为0.054 ng/mL，LOQ为0.12 ng/mL；CysC为0.17 ng/mL和0.28 ng/mL。与台式成像仪的标准样本Pearson相关系数为0.998，10例临床样本分别为0.997（NGAL）和0.999（CysC）。
在讨论部分，研究人员指出尽管血清肌酐可能无法完全捕捉早期结构性肾脏损伤，生物标志物阳性/SCr阴性病例可能代表参考分类未捕获的肾脏损伤。虽然p-LFA的LOQ远低于报告临床截断浓度，仍需更大队列研究验证诊断性能并确定最优截断值。当前研究聚焦儿科尿液样本，但分析检测机制本身不存在年龄依赖性。未来需开展涉及成人患者群体的研究，以及针对AKI风险个体的纵向研究，以确定该检测能否在常规临床诊断前检测早期或亚临床肾脏损伤。所有测量均在控制的实验室条件下进行，未来研究将评估更宽温度范围内的性能。
研究结论部分翻译如下：研究人员开发并验证了一种用于AKI生物标志物快速、定量和POC检测的多重p-LFA。通过整合超亮纳米标记和比率荧光读数，该p-LFA达到了与标准ELISA相当的分析性能。集成样本/结合垫的引入显著缩短了样本到读数时间，同时保持了临床足够的灵敏度，使检测可在10分钟内完成。该多重p-LFA实现了NGAL和CysC的同步定量检测，并在儿科尿液样本中与ELISA测量值显示出强相关性。重要的是，与单生物标志物评估相比，NGAL和CysC的联合分析提高了AKI的诊断性能，实现了高临床灵敏度和特异性，诊断准确度与基于ELISA的检测相当。这些结果凸显了多重生物标志物测量对于早期AKI风险分层的临床价值。最后，将p-LFA与低成本便携式荧光读数仪集成，可在显著降低仪器成本、尺寸和操作复杂度的同时，实现与台式扫描仪相当的准确定量分析。多重p-LFA条带与便携式读数仪的结合为真正的POC AKI诊断建立了实用路径。该研究展示了一种可扩展且适应性强的p-LFA平台，在实验室级别免疫检测和快速、低成本POC检测之间架起了桥梁。除了AKI，本研究提出的多重p-LFA策略还可广泛应用于其他需要去中心化医疗环境中进行灵敏、定量和多重生物标志物检测的临床场景。
