益生菌是活的微生物，当以适当剂量摄入时，可为宿主带来健康益处。乳酸菌和双歧杆菌菌株是最常用的益生菌，其潜在的健康益处主要包括维持肠道微生物群平衡、调节免疫反应和代谢功能、改善胃肠道功能障碍以及调控肠脑轴。(1,2)
人体肠道中结合型胆酸向游离型胆酸的生物转化
回肠末端和盲肠结肠是益生菌发挥其生物学功能的主要部位。回肠末端是益生菌介导免疫调节的主要场所，因为这里有大量的派尔集合淋巴结，它们能够促进益生菌与免疫细胞之间的相互作用，并引发针对性的免疫反应。(11)而盲肠结肠则是益生菌发挥其他非免疫功能的主要场所，比如调节代谢功能、改善胃肠道功能障碍以及调控肠脑轴。这些功能主要是通过多种微生物代谢产物（如短链脂肪酸、色氨酸代谢产物）来实现的。(12,13)
然而，这些远端肠道部位的胆酸组成与近端小肠有很大差异。十二指肠直接接收来自胆囊的胆汁，其中的胆酸几乎都是结合型的，餐后浓度可达10–20 mM，空腹时则为3–4 mM。(14)但由于回肠的再吸收作用以及共生细菌产生的胆盐水解酶活性，肠道内胆酸的浓度和组成会发生显著变化。因此，在回肠的中段到远端，总胆酸浓度会降至2–6 mM，其中大约一半为游离态（未结合态）。(14,15)在盲肠结肠中，胆酸浓度还会进一步下降，约为0.2–0.6 mM，具体数值因个体差异而异，但至少90%的胆酸处于游离状态。(15,16)
一般来说，游离态胆酸对益生菌菌株的生长抑制作用要比结合态胆酸强得多。(17,18)由于游离态胆酸的疏水性更强，它们更容易积聚并穿透细菌细胞膜，从而产生强烈的细胞毒性。因此，摄入的益生菌在体内面临的主要生长抑制因素很可能是游离态胆酸，而非结合态胆酸。
传统牛胆汁为基础的耐胆汁性检测方法的局限性
在传统的牛胆汁为基础的耐胆汁性检测中，有三个不可控变量可能会影响该模型的生理相关性以及不同菌株、不同研究之间对比结果的可靠性：测试菌株的胆盐水解酶活性、培养基的pH值，以及牛胆汁中的胆酸含量和组成。
未被考虑的胆盐水解酶活性
候选益生菌菌株可能具有胆盐水解酶活性，也可能没有。在含有牛胆汁的培养基中进行的检测中，具有胆盐水解酶活性的菌株会在培养过程中主动水解结合型胆酸，从而逐渐释放出游离态胆酸。因此，即使是在相同的培养系统中，具有胆盐水解酶活性的菌株所处的胆酸环境也与没有该酶活性的菌株存在显著差异。这种差异可能会使耐胆汁性数据的直接对比变得复杂，解读结果时需加以考虑。
无法控制的培养基pH值
在培养过程中，细菌会发酵碳水化合物，产生有机酸（主要是乳酸和醋酸），这些酸会使培养基变酸，增加带正电荷（不带电、疏水性更强）的胆酸比例，进而提升它们对候选益生菌菌株的细胞毒性。(19)由于不同候选菌株的产酸能力存在差异，如果在检测时不控制pH值，就会为不同菌株创造不同的pH环境。这又引入了一个不可控变量，进一步降低了不同菌株之间对比结果的可靠性。
标准不统一的牛胆汁成分
市售的牛胆汁是一种标准不统一的粉末状生物试剂。由于牛源胆汁及生产过程的差异，不同厂家生产的牛胆汁（例如Merck KGaA公司的未分离的黄褐色B3883产品与BD公司纯化的白色BD-212820产品），甚至同一厂家不同批次的产品，其总胆酸含量以及各种胆酸的组成都可能存在很大差异。这类差异即便在其他实验参数保持一致的情况下，也会降低不同研究之间耐胆汁性数据的可比性。
建立具有生理代表性的耐胆汁性检测方法的可行路径
为了解决这些局限性，有必要对耐胆汁性检测方法进行彻底改革。首先，应更换胆酸底物。应该使用一种能与目标肠道部位的生理胆酸组成和浓度相匹配的标准化胆酸混合物来替代牛胆汁，例如，用于回肠远端的胆酸浓度应为0.5–2 mM，用于盲肠结肠的则为0.2–0.6 mM。(14?16)这样的设计能够模拟益生菌在目标肠道部位所面临的主要抑制因素。其次，必须严格控制检测条件。应使用不可代谢的缓冲剂将培养基的pH值稳定在生理范围内的6.0–7.5之间。(20)同时，接种的菌液浓度应控制在≤1‰（体积/体积）左右，以避免测试菌株产生过多酸液。(21)通过这些措施，可以减少因测试菌株在培养过程中产生有机酸而导致培养基过度酸化的情况，进而降低因菌株差异带来的pH值波动。这种体外模型有望生成高度可重复、具有生理相关性的数据，这些数据可被用于类推人体肠道的情况，便于进行不同菌株、不同研究之间的严格对比，也有助于推动益生菌耐胆汁性研究领域的数据标准化。
