Meprin在脑细胞外基质和神经元周网中的作用

《The FASEB Journal》：The Role of Meprins on the Brain Extracellular Matrix and Perineuronal Nets

　　

Meprin α和meprin β是锌依赖性金属蛋白酶（metalloproteases），在肠道和肾脏组织中高表达，并以同二聚体和异二聚体形式存在。在肾脏和肠道中，它们参与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组装和炎症反应调控。然而，meprin β近期受到关注，因其可产生阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）特异性的Aβ肽，并可切割脑内神经元周网（perineuronal nets, PNNs）的主要组分brevican。PNNs可稳定突触，从而调控可塑性和记忆形成。在meprin β转基因小鼠中，brevican切割与空间记忆形成受损及CA1区长时程增强（long-term potentiation, LTP）受损相关。此外，大量研究表明AD中PNN组分存在调控紊乱。尽管如此，PNN蛋白水解重塑的生理和病理功能仍不明确。本研究鉴定了meprin α在brevican切割中的重要作用，其共表达增强了meprin β对brevican的催化活性。此外，N-端组学（N-terminomics）分析鉴定了meprin β在脑内的新型底物：神经聚糖（neurocan）和受体蛋白酪氨酸磷酸酶ζ（receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta, RPTPζ），二者均为PNN的关键组分。meprin α和meprin β对RPTPζ的切割在体外得到验证。为评估meprin介导的蛋白水解对脑细胞外基质的功能影响，研究人员利用免疫荧光和电子显微镜在体研究了PNNs和突触组织结构。meprin介导的蛋白水解破坏了meprin β转基因小鼠海马CA1区的PNN结构并降低突触密度。该研究确立了meprin依赖性PNN重塑作为导致突触功能障碍的新机制。

记忆在健康与疾病状态下的形成、巩固和储存，是当代神经科学中最具吸引力的课题之一。研究人员经过多年探索，已揭示多种细胞内和细胞外过程参与记忆的形成、巩固和储存，但其机制仍未完全阐明。其中，神经元周网（perineuronal nets, PNNs）的形成是影响长时记忆形成和储存的重要过程。PNNs是致密的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）结构，主要包裹大脑皮层和海马中的γ-氨基丁酸能小清蛋白阳性中间神经元（gamma-aminobutyric acidergic parvalbumin-positive interneurons, PV+ interneurons），在神经发育中与关键期关闭密切相关，通过限制幼年期可塑性并以晶格样结构包裹神经元和突触发挥功能。PNNs由硫酸软骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycans, CSPGs）如brevican、聚集蛋白聚糖（aggrecan）、神经聚糖（neurocan），以及连接蛋白如受体蛋白酪氨酸磷酸酶ζ（receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta, RPTPζ）、透明质酸与蛋白聚糖连接蛋白1（hyaluronan and proteoglycan link protein 1, HAPLN1）、腱生蛋白R和C（tenascin-R and -C）、透明质酸等组成。

PNNs在记忆形成和突触可塑性中发挥关键作用，因其被认为可结构性稳定突触接触。既往研究主要聚焦于软骨素酶ABC（chondroitinase ABC, ChABC）介导的硫酸软骨素（chondroitin sulfate, CS）侧链消化，该催化过程可抑制听觉恐惧条件化记忆形成、损害可卡因诱导位置偏好记忆的获取和再巩固，并可实现成年小鼠恐惧条件化记忆的擦除。为评估硫酸软骨素蛋白聚糖对记忆的影响，研究人员构建了多种蛋白聚糖基因敲除小鼠模型。brevican和neurocan敲除小鼠表现出海马CA1区长时程增强（long-term potentiation, LTP）受损，brevican和RPTPζ敲除小鼠则显示PNNs结构受损。进一步研究表明brevican可调节α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor, AMPAR）和钾通道在突触的定位，影响短时突触可塑性。

鉴于PNNs组分和完整性受动态调控，越来越多的关注聚焦于可能影响重塑进而影响神经可塑性的ECM修饰酶。金属蛋白酶是一类重要的调控因子，能够加工ECM组分和相关蛋白。meprin α和meprin β作为虾青素家族（astacin family）的锌依赖性金属蛋白酶，四十余年前首次发现于小鼠肾脏和肠道组织，参与组织修复和炎症反应调控，后于多种额外组织中发现其表达。它们被鉴定为炎症性肠病、急性肾损伤和糖尿病肾病的易感基因，并参与皮肤ECM重塑。meprin β的已知底物包括E-钙黏蛋白（E-cadherin）、半乳凝素3（galectin 3）、前胶原III（procollagen III）、黏蛋白2（mucin 2）和淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）。近期研究因发现meprin β在阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）中过表达，以及其介导APP产生N端截短的Aβ_1-40和Aβ_2-40肽而转向对其脑功能的关注。相比之下，meprin α在脑中的作用所知甚少，但研究已鉴定reelin为其在小脑颗粒神经元中的底物。

meprin β与meprin α虽共享55%的蛋白酶结构域氨基酸序列同一性并具有相似的切割特异性，但关键结构差异在于meprin α独特的"插入结构域"（inserted domain），其含有弗林蛋白酶（furin）切割位点，使meprin α在高尔基体经furin介导切割后以分泌形式存在；而meprin β主要保持膜结合状态，但可被ADAM10/17以其无活性形式脱落。细胞外，两种meprin的酶原通过胰蛋白酶样活性的蛋白酶（如matriptase-2）切割N端前肽而激活。生理上，两者均形成同二聚体，分泌型meprin α同二聚体可在胞外寡聚化形成兆道尔顿级别的大型蛋白酶复合物。有趣的是，鼠源和人源meprin α与meprin β亚基均能够形成异二聚体，使meprin α亚基通过meprin β亚基锚定于细胞表面，且异二聚化可增强两种亚基的催化活性。

为深入探究meprins在中枢神经系统中的作用，研究人员构建了特异性在海马和皮层神经元过表达meprin β的转基因小鼠模型。这些小鼠表现出显著的空间学习和LTP受损，且该表型不能归因于APP加工。通过高效十一醛基N端富集（High-Efficiency Undecanal-based N-Termini EnRichment, HUNTER）N-端组学分析，brevican被鉴定为meprin β的新型底物，可能促成观察到的表型。

本研究旨在探究meprin α在brevican切割中的作用，并考察neurocan和RPTPζ作为meprin β可能的新型蛋白水解底物，其蛋白水解也可能 contributes to meprin β过表达动物中的观察表型。由于这些蛋白均为PNNs的关键组分，研究人员进一步研究了meprins对脑ECM、PNNs和突触结构的影响。

研究采用的主要关键技术方法包括：利用NEX驱动子在hippocampal和cortical神经元特异性过表达meprin β的转基因小鼠（mepβ^Cre;TG/wt及其对照mepβ^Cre;wt/wt，样本来源于德国美因茨大学中央动物设施的动物）；HUNTER N-端组学分析蛋白水解切割位点；CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MEP1A和MEP1B敲除的HEK293T细胞系；细胞共转染实验验证底物切割；重组可溶性meprin β（sMeprin β）的体外消化实验；细胞表面生物素化实验检测蛋白定位；SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹分析蛋白表达；透射电子显微镜分析突触密度；免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察PNNs结构。

研究结果如下：

**Meprin β在E461↓E462、K464↓E465和E584↓E585位点切割brevican。** 通过对12月龄mepβ^Cre;TG/wt和mepβ^Cre;wt/wt动物脑裂解物进行N-端组学分析，研究人员鉴定出三个在转基因小鼠中显著增加的brevican N端片段，其切割位点均为酸性氨基酸（E在P1/P1′位），符合meprin β典型切割特异性。同时发现四个在转基因小鼠中显著减少的brevican片段，可能指示除meprin β外其他蛋白水解过程的抑制。为验证人brevican的蛋白水解切割，研究人员在HEK 293T细胞中共转染myc标签人brevican与人meprin β或催化失活的meprin β E153A变体，SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹显示meprin β转染细胞中全长brevican显著减少，而meprin β E153A转染细胞中则无此现象，证实了人meprin β对人brevican的体外蛋白水解作用。

**可溶性重组meprin β同二聚体切割brevican。** 为检测脱落的重组meprin β同二聚体（sMeprin β）能否消化全长brevican，研究人员将brevican转染的HEK 293T细胞裂解物与活化sMeprin β孵育。结果显示，与mock溶液孵育60分钟相比，活化sMeprin β孵育组全长brevican显著减少，而该减少可被meprin β抑制剂fetuin-B部分挽救。单独孵育或mock孵育不改变全长brevican蛋白水平。该体外分析表明sMeprin β可切割全长brevican，确证brevican为meprin β的直接底物。

**Meprin β与meprin α共表达时的brevican切割。** 鉴于meprin α/β异二聚体在荧光活性检测中表现出增强的催化活性，研究人员探究了meprin α在brevican切割中的作用。在CRISPR-Cas9介导的meprin α敲除（MEP1A-knockout）HEK293T细胞中，meprin β与brevican共转染未检测到全长brevican的显著减少。为检测meprin α单独是否能切割brevican，在meprin β敲除（MEP1B-knockout）细胞中进行的实验表明，meprin α同二聚体单独不能显著切割brevican。然而，在MEP1B-knockout细胞中三重共转染brevican、meprin β和meprin α，与仅转染brevican相比，brevican蛋白水平显著降低，表明meprin β与meprin α共表达可增强meprin β介导的brevican加工。当meprin α与催化失活的meprin β E153A共表达时，未观察到对brevican切割的显著贡献。综上，meprin β在brevican切割中起核心作用，meprin α可能通过增强meprin β催化活性而发挥重要作用，但尚不能确定该效应源于meprin α/β异二聚化还是对meprin β定位、稳定性或活性的影响。

**N-端组学中的neurocan切割。** Neurocan作为另一种CSPG、凝集素样蛋白聚糖家族成员和PNNs结构组分，在N-端组学分析中被鉴定为可能的meprin β新底物。在mepβ^Cre;TG/wt动物中鉴定出三个显著过表达的N端肽段，其切割位点紧邻信号肽酶切割位点。为在体外验证，研究人员将C端6xHIS标签的neurocan与meprin β共转染至HEK 293T细胞，但未检测到全长neurocan蛋白水平的显著变化。由于SDS-PAGE无法解析大于150 kDa蛋白中6个氨基酸的差异，该实验配置无法可靠检测neurocan切割，因此不能得出关于meprin介导neurocan加工的明确结论。

**Meprin β和meprin α切割RPTPζ。** RPTPζ是参与突触可塑性和学习的膜结合受体，为PNNs的关键组分，通过与tenascin-R合作将透明质酸链锚定至细胞而参与PNN形成。N-端组学分析鉴定RPTPζ为可能的meprin β底物，其在mepβ^Cre;TG/wt动物中显著过表达的片段由E430↓E431位点切割产生，该位点符合meprin α和meprin β的切割偏好。共转染实验证实，meprin β、meprin β E153A及meprin α均可降低RPTPζ全长蛋白水平，表明两者均可切割RPTPζ。值得注意的是，催化失活的meprin β E153A仍能降低RPTPζ水平，提示与其异二聚化的内源性meprin α可能发挥切割作用。

**Meprin β介导的PNNs结构和突触密度影响。** 为检测brevican和RPTPζ的蛋白水解加工是否影响PNN结构，研究人员对mepβ^Cre;TG/wt和mepβ^Cre;wt/wt小鼠脑片进行生物素化怀槐凝集素（Wisteria floribunda Agglutinin, WFA）染色。在mepβ^Cre;wt/wt动物中，PNNs表现为围绕神经元的致密网状结构，具有小孔为紧密包裹的突触留有空隙；而mepβ^Cre;TG/wt动物的PNNs显得不那么致密，几乎呈断裂状。电子显微镜进一步分析显示，mepβ^Cre;TG/wt动物海马CA1区突触密度有减少趋势（因缺乏重复样本未进行统计分析）。这些结果表明，mepβ^Cre;TG/wt小鼠中brevican和RPTPζ的切割可导致PNNs结构受损和突触接触减少。

研究讨论与结论部分总结如下：本研究确立了meprin介导的蛋白水解切割PNN组分brevican和RPTPζ，可能损害PNN结构和突触可塑性。研究结果突出了meprins作为AD及其他非痴呆相关性认知障碍治疗靶点的前景。具体而言，meprin β在重组可溶性和膜结合同二聚体中切割brevican，meprin α共表达可能增强meprin β的催化活性，N-端组学分析将对应切割位点定位至E461↓E462、K464↓E465和E584↓E585。研究人员还计算了人brevican中保守切割位点及产生片段的分子量，与蛋白质免疫印迹观察到的片段大小相符。对于neurocan，虽然N-端组学提示其为meprin β底物，但由于方法学限制未能体外确证，且推测其切割可能对ECM结构影响微小。RPTPζ被确定为meprin β和meprin α的新型底物，但生理条件下何种meprin变体负责E430↓E431位点的切割尚不明确。

mepβ^Cre;TG/wt小鼠此前已被观察到空间记忆和LTP受损，与RPTPζ敲除小鼠和brevican敲除小鼠的表型相似。研究人员假设，meprin在hippocampal CA1区对这些PNN组分的切割和PNN结构的破坏，可能导致Morris水迷宫实验中的空间学习降低和此前报道的CA1 LTP受损。meprin介导的ECM重塑代表了突触可塑性和学习病理生理学中的新机制。此外，mepβ^Cre;TG/wt小鼠CA1区突触密度减少的趋势与tenascin C、tenascin R、brevican和neurocan联合敲除小鼠中抑制性突触减少的发现一致。研究人员提出，meprin介导的PNN组分消化可能通过削弱结构支持而破坏突触接触的稳定性。

与既往主要关注ChABC消化PNNs的研究不同，ChABC消化代表了一种非生理性的ECM重塑，因该酶在哺乳动物中并非内源性表达。本研究引入meprin β依赖的ECM和PNNs重塑作为生理相关的有前景靶点，用于进一步探究PNNs在神经环路功能和病理中的作用。鉴于meprin β还可切割APP形成毒性Aβ物种，且AD脑中发现meprin β mRNA升高，meprin依赖性ECM蛋白水解可能进一步影响AD病理。完整的PNNs被证明可在体外抵御毒性Aβ肽并限制过度磷酸化TAU蛋白的内化。因此，meprin β介导的brevican和RPTPζ蛋白水解加工可能促成更广泛的认知损害。总之，该研究要数meprin介导的PNN组分蛋白水解切割可能损害PNN结构和突触可塑性，研究结果发表于《The FASEB Journal》。