投射至腹内侧纹状体(VMS)的内侧前额叶皮层(mPFC)神经元活性编码雄性小鼠对慢性束缚应激的个体易感性

《Neurobiology of Stress》：Activity of VMS-projecting mPFC neurons encodes individual vulnerability to chronic restraint stress in male mice

　　

摘要：内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex, mPFC)在应激相关行为的调控中发挥关键作用，尤其是投射至腹内侧纹状体(ventromedial striatum, VMS)的神经元亚群。然而，投射至VMS的mPFC神经元是否参与个体对慢性应激行为反应的差异性尚不清楚。本研究采用慢性束缚应激(chronic restraint stress, CRS)模型，观察到CRS诱导的行为反应存在异质性，并根据复合应激相关行为学特征将小鼠分为相对易感(susceptible, SUS)组和抵抗(resilient, RES)组。为探究潜在神经机制，研究人员利用活体(in vivo)纤维光度法(fiber photometry)监测CRS前(基线期)、期间及之后投射至VMS的mPFC兴奋性神经元的钙离子(Ca2+)动态。研究发现，即使在应激暴露前，SUS小鼠的峰值ΔF/F信号即显著高于RES小鼠，且在CRS期间及之后持续呈现活性升高。离体(whole-cell)全细胞膜片钳记录显示，SUS小鼠中投射至VMS的mPFC神经元内在兴奋性增加，表现为去极化电流注入诱发动作电位发放增强。化学遗传学(chemogenetics)激活该群神经元可加剧应激相关行为，而抑制则可减轻易感小鼠的CRS相关行为异常。此外，未来需明确上述mPFC–VMS环路特征是否适用于雌性动物。综上，结果表明投射至VMS的mPFC神经元是关联个体应激相关行为易感性差异的候选神经底物。

论文解读——投射至腹内侧纹状体(VMS)的内侧前额叶皮层(mPFC)神经元活性编码雄性小鼠对慢性束缚应激的个体易感性

该研究发表于《Neurobiology of Stress》。

研究背景与立项依据

慢性应激是焦虑相关行为和刻板样行为异常等应激相关神经精神表型的重要环境危险因素，但暴露于相似应激源的个体在行为结局上存在显著异质性——部分发展为明显的应激相关行为改变（易感/susceptible, SUS），部分则保持相对抵抗(resilient, RES)。理解这种个体差异背后的神经机制对识别应激易感与抵抗的环路基础至关重要。mPFC是情绪和动机状态"自上而下"调控的关键枢纽，其向不同下游靶区的投射对应激和焦虑相关行为有不同甚至相反的作用。VMS（腹内侧纹状体，ventromedial striatum）作为mPFC的主要下游靶区，参与情感和动机过程及应激相关行为调节，但投射至VMS的mPFC神经元活性是否与慢性应激易感或抵抗相关联仍不清楚。已有证据表明个体对应激的易感性可能根植于应激前既存在的神经环路功能差异，因此本研究假设：投射至VMS的mPFC兴奋性神经元在CRS前的活性差异可能与后续应激相关行为易感性有关，并对此进行验证。

主要关键技术方法概述

研究人员使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，建立10天慢性束缚应激(chronic restraint stress, CRS)模型，对照组(CTRL)同期只做抓取 handling。采用逆行病毒标记结合纤维光度法(fiber photometry, 表达jGCaMP6s)在自由活动小鼠中记录投射至VMS的mPFC兴奋性神经元Ca²⁺动态，分基线期(CRS前)、CRS首日(期间)及CRS后三阶段。通过高架十字迷宫(elevated plus maze, EPM)开臂停留比与进入比、喷水刺激诱发理毛(grooming)次数与时长四项指标计算复合应激相关行为评分，将CRS暴露小鼠划分为SUS组和RES组。离体全细胞膜片钳记录逆行标记的VMS投射mPFC神经元以评估内在兴奋性。采用Cre依赖的DREADD(designer receptors exclusively activated by designer drugs, 化学遗传学)病毒系统——hM3Dq(Gq)激活或hM4Di(Gi)抑制该投射，腹腔注射氯氮平-N-氧化物(clozapine N-oxide, CNO)验证因果调控关系。统计学采用t检验、ANOVA、Kruskal–Wallis及Pearson相关分析。

研究结果

4.1. Chronic restraint stress induces stress-related behavioral alterations（慢性束缚应激诱导应激相关行为改变）

CRS组与CTRL组在开场实验(open field test, OFT)总移动距离、中央区停留时间及进入次数无显著差异；EPM中CRS组开臂停留比显著降低，开臂进入比无显著差异；大理石掩埋测试(marble burying test, MBT)埋球数两组无显著差异但有变化趋势；理毛测试中CRS组喷水刺激后理毛时间显著增加，理毛次数无显著变化，基线条件无组间差异。表明CRS主要引起开臂探索减少和应激诱发理毛延长，未导致一般运动抑制。

4.2. Divergent susceptibility to CRS-induced stress-related behavioral alterations（CRS诱导的应激相关行为改变存在异质性）

基于EPM开臂停留比、开臂进入比、喷水刺激后理毛次数与理毛时间四项指标的ROC确定截断值，计算复合评分(0–4分)，评分≥3定为SUS(n=16)，≤2定为RES(n=17)。行为验证显示SUS组EPM开臂停留比和进入比均显著低于CTRL和RES组，RES组与CTRL无差异；SUS组喷水刺激后理毛次数高于RES组，理毛时间长于CTRL组。证实CRS暴露小鼠行为反应存在异质性，可分SUS与RES亚组。

4.3. CRS-susceptible mice exhibit elevated pre-CRS activity in VMS-projecting mPFC neurons（CRS易感小鼠在应激前即表现投射至VMS的mPFC神经元活性升高）

纤维光度法记录基线期自由活动探索时VMS投射mPFC神经元Ca²⁺信号，SUS组峰值ΔF/F及钙信号曲线下面积(AUC)均高于RES组(峰值ΔF/F SUS vs RES p=0.0300)，CTRL与SUS无显著差异。个体水平峰值ΔF/F与复合行为评分呈显著正相关(r=0.6277, p=0.0387)，AUC呈正相关趋势但未达显著。表明SUS小鼠在CRS暴露前即存在VMS投射mPFC神经元自发钙活性升高，且该基线活性与后续应激相关行为易感性正相关。

4.4. VMS-projecting mPFC neurons exhibit elevated activity during CRS and increased intrinsic excitability after CRS in susceptible mice（易感小鼠VMS投射mPFC神经元在CRS期间活性升高，CRS后内在兴奋性增加）

CRS首日束缚过程中SUS组钙瞬变峰数多于CTRL组，平均ΔF/F高于CTRL组，与RES差异未达显著。CRS后24小时内自由活动记录显示SUS组AUC和峰值ΔF/F高于CTRL组(与RES差异未达显著)，但个体水平AUC(r=0.6061, p=0.0216)和峰值ΔF/F(r=0.5767, p=0.0309)均与复合行为评分显著正相关。离体全细胞膜片钳显示SUS组VMS投射mPFC神经元动作电位阈值更低、相同去极化电流下发放频率高于CTRL和RES组(p<0.0001)。表明SUS小鼠该投射神经元在应激期间及后仍呈高活性，且CRS后具有更高的内在兴奋性，为活体观察提供细胞水平证据。

4.5. Chemogenetic activation of VMS-projecting mPFC neurons increases stress-related behaviors（化学遗传学激活VMS投射mPFC神经元增加应激相关行为）

未经历CRS的na?ve小鼠给予CNO激活hM3Dq(Gq)组与mCherry对照比较：OFT总移动距离增加但中央区停留时间无差异；EPM开臂停留时间减少，开臂进入比无差异；喷水刺激后理毛时间增加，理毛次数呈边缘性增加；MBT无差异。c-Fos免疫荧光验证DREADD激活有效。表明激活该投射本身可在na?ve动物诱发类似应激相关的焦虑样及过度理毛表型。

4.6. Chemogenetic inhibition of VMS-projecting mPFC neurons attenuates CRS-associated behavioral alterations in susceptible mice（化学遗传学抑制VMS投射mPFC神经元减轻易感小鼠CRS相关行为异常）

CRS-SUS小鼠给予CNO抑制hM4Di(Gi)组(SUS^4di?CNO)与同批给予生理盐水(SUS^4di-saline)及CTRL^mCherry?CNO比较：OFT总移动距离各组无差异，中央区时间无显著差异；EPM各指标无组间差异；MBT中SUS^4di-saline埋球数多于CTRL，SUS^4di?CNO与CTRL无差异；喷水刺激后SUS^4di-saline理毛时间和次数多于CTRL，SUS^4di?CNO恢复至与CTRL无差异。表明抑制该投射可特异性逆转SUS小鼠部分CRS相关行为异常（理毛增强和刻板埋球）。

讨论与结论总结

讨论指出mPFC具异质性，不同投射对应激行为影响不同；本研究鉴定出VMS投射mPFC神经元是关联CRS行为易感的投射定义神经元群。关键发现是SUS小鼠在CRS前即存在该投射神经元基线钙活性升高，提示应激易感性可能反映预先存在的环路水平差异——即"潜伏的前纹状体环路(prestriatal circuit)特征"塑造个体应激反应。电生理证实CRS后SUS小鼠该群神经元内在兴奋性增加，与活体高活性互为印证。纤维光度群体钙活动与个体复合行为评分呈梯度相关，支持mPFC–VMS环路活性与应激行为易感性间为连续关联而非单纯SUS/RES二分。化学遗传学双向操控证实该通路对应激相关行为有因果贡献。作者也指出局限性：仅用雄性小鼠、四指标分类为CRS相关行为易感性的相对指标、纤维光度法为群体水平测量、DREADD缺乏单神经元电生理直接验证、VMS内异质性下游机制未阐明、仅用C57BL/6J近交系。

研究结论（翻译自Discussion末段）：

总之，本研究发现投射至VMS的mPFC神经元基线活性升高及CRS后内在兴奋性增加与个体对CRS诱导的应激相关行为改变的易感性相关联。这些结果为未来研究mPFC–VMS通路通过何种分子、细胞和环路机制塑造个体对慢性应激的反应提供了基础。