犬认知功能障碍的脑矿物质浓度研究

《The Veterinary Journal》：Brain mineral concentrations in canine cognitive dysfunction

　　

犬认知功能障碍（CCD）是一种在老年犬中普遍存在的与年龄相关的神经退行性疾病，其与阿尔茨海默病（AD）具有若干共同特征。尽管矿物质稳态失调被认为与AD的发病机制有关，但其在CCD中的作用在很大程度上仍未得到探索。这项回顾性研究旨在调查24只CCD犬和15只表现出成功认知老化（非CCD）犬的脑部区域矿物质浓度。CCD的诊断基于在排除任何其他颅内疾病后，通过看护者问卷、体格检查和实验室分析的结果。研究人员分析了四个具有高β-淀粉样蛋白病理特征的皮质区域（前额叶、顶叶、颞叶和枕叶皮质）和一个通常不受影响的区域（小脑），通过基于等离子体的光学技术和质谱法测定了20种矿物质的浓度。与非CCD犬相比，CCD犬在特定脑区的Ca（钙）、Fe（铁）、Mg（镁）、Mn（锰）和Zn（锌）浓度显著较低，而Cd（镉）、Mo（钼）、Ni（镍）和Pb（铅）的水平较高。在CCD中受影响最早且最一致的前额叶皮质中观察到最多的显著差异，而小脑则基本保持不变。主成分分析将CCD犬与非CCD犬区分开来，并且在CCD组内，小脑与皮质区域分别聚类。这些改变的区域特异性及其区分CCD与非CCD犬的能力，支持了矿物质稳态紊乱与CCD之间存在关联。值得注意的是，较低的浓度影响了参与抗氧化防御、神经元信号传导和神经传递的必需微量元素，这引发了对其功能影响的可能性的探讨，值得进一步研究。

**犬认知功能障碍脑矿物质浓度研究的解读**

**研究背景与问题**
犬认知功能障碍（CCD）是一种影响老年犬的慢性神经退行性疾病，会导致行为改变，损害犬只及其看护者的福利。其临床症状包括定向障碍、社交互动改变、睡眠-觉醒周期紊乱、记忆和学习能力下降、室内训练习惯丧失以及焦虑和躁动增加。尽管该病较为普遍且近年研究有所增加，但CCD的诊断仍严重不足，其患病率随年龄增长而上升。CCD与人类阿尔茨海默病（AD）具有许多相似之处，犬只被认为是AD的最佳自然模型之一，因为它们会自发地发生CCD，无需基因操作，且与人类共享环境，具有更广泛的遗传多样性。两种疾病都以一系列神经病理学改变为特征，包括神经毒性蛋白β-淀粉样蛋白在脑实质和脑血管壁（淀粉样血管病）的沉积、皮质萎缩、脑室扩大、神经元丢失、神经发生减少、神经递质改变以及脑内氧化损伤增加。值得注意的是，CCD中观察到的变化似乎代表了AD神经退行性变的早期阶段，这使其成为研究早期AD的合适模型。

然而，尽管AD是一个主要的全球健康问题，但目前尚无治愈方法（CCD亦然）。因此，需要持续的研究努力，而采用“一体化健康”方法对两个物种都有益。两种疾病的病理生理学复杂且尚未完全明了；人类医学中提出的众多假说涉及β-淀粉样蛋白毒性及其他蛋白质病、脑血管变化、线粒体功能障碍、氧化应激、脂质过氧化、神经炎症、矿物质以及肠-脑轴等因素。最近的一种整合观点认为，其中几种机制可能共同促成AD的发生和发展，这在CCD中可能也是如此。与矿物质相关的机制是AD研究的一个活跃领域，但在CCD中仍未得到充分探索。AD患者脑、脑脊液和血清中的矿物质浓度与非AD个体不同，并且随着疾病进展出现特定的模式。矿物质的作用已与上述其他假说进行了广泛研究。在脑部，矿物质有助于调节氧化应激和炎症。一些元素，如铜（Cu）、铁（Fe）和汞（Hg），可能促进β-淀粉样蛋白的产生、聚集和/或沉积，而另一些元素，包括锌（Zn）、硒（Se）和钙（Ca），似乎对疾病有积极影响。相比之下，尽管看护者经常给犬只补充含矿物质的补充剂，但目前关于CCD矿物质状态的信息仍然缺乏。迄今为止，尚无研究评估CCD犬脑部区域矿物质浓度。鉴于CCD和AD的重要性以及矿物质在AD中的作用，本研究旨在检查和比较临床诊断为CCD的犬只与经历成功认知老化的犬只的脑矿物质浓度。

**研究方法**
本研究是一项回顾性病例对照研究，使用了来自39只犬的脑组织样本库样本。所有动物均根据当时的欧洲和西班牙动物处理法规进行处理，实验程序获得了圣地亚哥德孔波斯特拉大学伦理委员会的批准。犬只被分为CCD组（24只）和非CCD组（15只）。分组基于全面的临床诊断，包括使用看护者报告的观察问卷（González-Martínez等人，2011）和犬痴呆问卷（Rofina等人，2006），以及全面的体格、神经学检查和实验室分析。研究人员分析了四个已知具有高β-淀粉样蛋白病理特征的皮质区域（前额叶、颞叶、顶叶和枕叶皮质）和一个通常不受影响的区域（小脑）。通过微波辅助酸消化处理样本后，使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定常量矿物质（Ca、K、Mg、Na、P、S）浓度，并使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定微量元素（包括必需和非必需元素，如As、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Hg、Mn、Mo、Ni、Pb、Se、Sb、Zn）浓度。严格的质量控制程序包括程序空白、认证参考物质和重复分析。数据分析采用t检验、Mann-Whitney U检验、方差分析、相关性分析以及主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）等化学计量学方法。

**研究结果**
**3.1 犬只特征**
CCD组和非CCD组在年龄、性别或体型方面无显著差异。品种构成具有异质性，两组均以混种犬为主。

**3.2 脑矿物质浓度**
与对照组相比，CCD犬在特定脑区显示出显著的矿物质浓度差异。
* **常量矿物质**：仅在**前额叶皮质**中，CCD犬的**Ca**和**Mg**浓度显著低于非CCD犬。其他区域仅显示出Mg、Na和P的微小趋势差异。
* **必需微量元素**：**Fe**、**Mn**、**Mo**和**Zn**的浓度存在显著差异。**前额叶皮质**和**顶叶皮质**观察到最多的组间显著差异：在前额叶区域，Fe、Mn和Zn浓度较低；在顶叶皮质，Fe、Mn和Mo浓度较低（Zn有差异趋势）。**颞叶皮质**显示Mn有差异（Mo有趋势）；**枕叶皮质**显示Zn和Mo有差异；**小脑**仅Mo有差异。在所有情况下，CCD组的Fe、Mn和Zn浓度均较低，而Mo水平较高。
* **非必需元素**：**Cd**、**Ni**和**Pb**存在显著差异。Cd在前额叶皮质有差异；Ni在前额叶、顶叶和枕叶皮质有差异；Pb在所有区域（除小脑仅有趋势外）均有差异。在所有情况下，这些元素的浓度在CCD组中较低。
* **区域分布**：在CCD组内，矿物质分布显示出区域特异性。例如，Cu在前额叶和颞叶皮质中的浓度低于小脑；Mn在脑中的水平低于小脑。这些模式在非CCD组中不明显或不同。
* **与问卷评分的相关性**：死亡前获得的问卷评分（可用于21只CCD犬）与大多数脑区的矿物质浓度无显著相关性，但与颞叶皮质的Na和Mo浓度呈正相关，与S浓度呈负相关。

**3.3 化学计量学分析**
* **主成分分析（PCA）**：PCA使用最具信息量的元素（As、Ca、Cd、Cr、Fe、Mg、Mn、Mo、Ni、P、Pb、Zn）进行。分析显示，CCD组和非CCD组（仅考虑皮质样本）之间存在明显区分，尽管存在部分重叠。在CCD组内，PCA显示皮质区域（尤其是前额叶皮质）与小脑明显分离，而在非CCD组中，各区域聚类更紧密，区分不明显。
* **层次聚类分析（HCA）**：HCA揭示了CCD组和非CCD组中元素关联的不同模式。在CCD组中，最强的关联出现在Ca与Pb、Mg与P以及As与Cd之间。在非CCD组中，元素之间的关联通常更紧密，特别是Ca、Mg和P之间，以及Mn和As之间。

**讨论与结论**
本研究首次调查了CCD犬的脑矿物质谱。分析揭示了CCD犬与年龄和性别匹配的非CCD犬之间在矿物质浓度和分布上存在明显差异。总体而言，CCD组中几种必需元素（Ca、Fe、Mg、Mn、Zn）的浓度较低，而Mo则相反。前额叶皮质表现出最多的组间显著差异，而小脑基本不受影响（Mo除外）。这种区域模式也反映在PCA中，在CCD组内，前额叶皮质与小脑形成不同的聚类，而在非CCD犬中这种分离不明显。这些改变的区域特异性支持了组间差异可能与CCD存在相关的解释。前额叶皮质是CCD中受影响最早且最一致的区域，通常表现出最明显的病理变化。小脑通常被认为在CCD中不受影响，仅Mo存在差异，这进一步支持了所观察到的矿物质浓度差异具有疾病特异性。

矿物质改变在AD中已有充分记载，但其在疾病机制中的作用复杂且尚未完全明了。本研究中观察到的矿物质变化表明，矿物质平衡紊乱可能通过与β-淀粉样蛋白毒性和氧化应激等其他过程的相互作用，参与CCD的病理生理学、疾病发展和进展。无论因果关系如何，CCD犬中必需元素总体水平较低值得注意，因为这些元素在中枢神经系统功能中起着关键作用。Zn、Mn和Fe在抗氧化防御中通过其在过氧化氢酶（Catalase）和超氧化物歧化酶（SOD）中的作用而汇聚。本研究中观察到的必需元素浓度较低，可能会损害这些酶并加剧氧化应激，而氧化应激是AD发病机制的核心假说，已知会促进β-淀粉样蛋白错误折叠和聚集等过程。关于常量矿物质，CCD犬前额叶皮质的**总Ca**和**Mg**浓度显著较低。在AD中，Ca稳态失调超出了总Ca水平，被认为是导致疾病发病的关键机制。Mg与Ca稳态密切相关。这些发现表明，Ca和Mg稳态紊乱可能通过影响神经元兴奋性和突触传递而参与CCD的病理生理学。**Mo**是唯一一个在CCD组中浓度显著较高的必需元素，但其增加在前额叶皮质并不明显，且小脑（通常不受疾病影响）也有升高，因此该模式表明升高的Mo水平可能与CCD无直接关系。**非必需元素**呈现出与必需矿物质不同的模式，总体而言，它们在非CCD犬中浓度往往更高，Ni、Pb和Cd存在显著差异。这些发现不支持非必需元素在CCD发展中的作用，观察到的差异可能反映了暴露的个体间变异和/或CCD相关的脑生理变化（包括灌注、代谢和血管清除），这些变化可能影响毒性元素的输送和积累，而非非必需元素在CCD中的因果作用。

本研究存在一些局限性，包括非CCD组并非完全健康的犬只、缺乏神经病理学分析（如β-淀粉样蛋白负荷评估）、横断面设计无法确定因果关系、缺乏详细的饮食、补充剂或环境暴露信息、分析技术无法捕捉空间分布、样本量相对较小等。尽管如此，该研究证明了CCD组和非CCD组之间矿物质浓度存在明显差异，这些发现既有与AD相似之处，也有不同之处，值得进一步研究。

**研究结论**：本研究首次评估了CCD犬的脑矿物质谱。研究发现，该疾病与几种必需元素的区域特异性改变相关，包括Ca、Fe、Mg、Mn和Zn水平降低以及Mo水平升高，同时非必需元素如Cd、Ni和Pb水平相对于年龄和性别匹配的非CCD犬升高。这些差异在前额叶皮质最为普遍，而小脑基本不受影响。这些改变的区域特异性，加上它们在多变量分析中区分CCD与非CCD犬的能力，支持了矿物质稳态紊乱与CCD之间存在关联。由于本研究的横断面性质，无法确定矿物质改变是先于CCD发生还是作为疾病的一部分发展。然而，浓度降低主要影响了参与抗氧化防御、神经元信号传导、神经传递和整体脑功能的必需微量元素，表明其潜在的功能相关性。需要进一步的研究来阐明矿物质稳态在CCD中的作用及其作为生物标志物或治疗靶点的潜力。