综述：基于mtDNA含量及mtDNA维持所需基因表达水平分析的纳米颗粒毒性评价：临床前研究的Meta分析

《Antioxidants》：Toxicity Evaluation of Nano-Sized Particles by Analysis of mtDNA Content and Expression Levels of Genes Required for mtDNA Maintenance: A Meta-Analysis of Pre-Clinical Studies

　　

线粒体改变，包括线粒体DNA（mtDNA）丢失和维持通路缺陷，已被认为是环境污染物毒性效应的重要驱动因素。因此，暴露于纳米颗粒（直径1–100 nm；一种新的环境污染源）也可能导致这些线粒体损伤；然而，已有研究结果存在争议。汇总截至2025年7月从三个电子数据库获取的可用研究进行全面评估。对19项体外研究（69个数据集）的Meta分析显示，暴露于纳米颗粒显著降低了mtDNA含量[标准化均数差 = ?1.08；P值 = 0.001]。在对相应体外和体内研究进行Meta分析后发现，mtDNA编码基因（ND1、COX1、2、CYTB、ATP6）、线粒体生物发生基因（SIRT1、PGC-1α、TFAM）和融合基因（MFN1、MFN2、OPA1）的表达水平显著下调，而裂变基因DRP1和FIS1在纳米颗粒暴露后上调。因此，mtDNA耗竭以及mtDNA编码和维持基因的表达紊乱可能是纳米颗粒暴露诱导疾病的重要促成因素。

1. 1.
   引言
   线粒体是存在于几乎所有真核生物中的半自主性细胞器，执行多种生物学功能以维持细胞存活，其主要作用是通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生能量（三磷酸腺苷，ATP）。OXPHOS由电子传递链的蛋白质复合物完成。大多数OXPHOS系统蛋白由核DNA（nDNA；79个）编码，少数由线粒体DNA（mtDNA；13个，包括来自复合物I的7个：ND1/2/3/4/4L/5/6，来自复合物III的1个：CYTB，来自复合物IV的3个：COX1-3，以及来自复合物V的2个：ATP6/8）编码。此外，mtDNA还编码两个核糖体RNA（rRNA）和22个转运RNA（tRNA）用于线粒体内的蛋白质合成。与核基因组相比，mtDNA更容易受到过量活性氧（ROS）的损伤，因为它不包装成具有保护性组蛋白的核小体，并且位于靠近线粒体内膜的OXPHOS系统（ROS的主要来源）附近。因此，mtDNA可能代表环境毒物诱导高能量需求器官疾病发生的优先靶标。
   有多种nDNA编码蛋白参与mtDNA维持。聚合酶γ（POLG）基因编码负责mtDNA复制的DNA聚合酶。线粒体转录因子A（TFAM）是一种DNA结合蛋白，可激活mtDNA转录以生成启动mtDNA复制所需的RNA引物。转录共激活因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）通过激活其下游转录因子核呼吸因子1（NRF1）或2（NRF2）促进mtDNA和蛋白质的合成以及新线粒体的生成，随后刺激TFAM的转录。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可以直接磷酸化PGC-1α或通过增加NAD+水平激活沉默信息调节因子1（SIRT1），进而使PGC-1α去乙酰化。此外，线粒体是高度动态的细胞器，经历周期性融合和裂变以维持线粒体结构并促进内容物交换（如mtDNA）。线粒体裂变由GTP酶发动蛋白相关蛋白1（DNM1L/DRP1）和锚定在线粒体上的衔接蛋白线粒体裂变1（FIS1）及裂变因子（MFF）控制，而线粒体融合由外膜（线粒体融合蛋白1和2：MFN1和MFN2）和内线粒体膜机制（GTP酶视神经萎缩蛋白1，OPA1）调节。因此，这些参与线粒体生物发生（AMPK/SIRT1-PGC-1α-NRF1/2-TFAM）、融合（MFN1、MFN2、OPA1）和裂变（DRP1、FIS1、MFF）的基因失调也可能作为环境健康危害的重要毒性效应。
   随着纳米材料（包括金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒、量子点、碳纳米管、石墨烯）和塑料在工业领域和日常生活中应用的不断增加，纳米颗粒（≤100 nm）不可避免地释放到环境中，并对生物体的健康产生不利影响。近年来，大量研究表明纳米颗粒可通过吸入、摄入和皮肤接触途径进入动物和人类体内，并在所有组织（血液、肺、肝、肾、脾、心、脑和睾丸）中积累引发相关损伤。尽管纳米颗粒的毒性机制仍不完全清楚，但氧化应激诱导的线粒体功能障碍已引起越来越多的关注。同时，已有Meta分析证实暴露于纳米颗粒可显著增加ROS水平，表明mtDNA含量和维持基因可能随后发生改变。这一假设在一些研究中得到支持；然而，关于不同纳米颗粒类型的结论似乎存在争议：有报道称二氧化硅纳米颗粒（SiNPs）显著降低mtDNA含量，下调PGC-1α、NRF1和MFN1，上调DRP1、FIS1和MFN2，但对OPA1和TFAM无显著影响；其他研究发现SiNPs处理的内皮细胞mtDNA、PGC-1α、NRF1、TFAM和OPA1显著降低，DRP1、FIS1和MFN2升高，但MFN1无显著变化；银纳米颗粒（AgNPs）处理的原代肺细胞上清液中mtDNA含量与对照组无显著差异；氧化锌纳米颗粒（ZnONPs）暴露对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的PGC-1α、MFN1、MFN2、MFF或DRP1蛋白表达水平无显著影响。这些发现凸显了全面调查mtDNA相关指标与纳米颗粒暴露之间关联的必要性，以获得更可靠的证据。
   现有的Meta分析文献已证实暴露于纳米颗粒可诱导nDNA损伤；然而，线粒体遗传毒性很少被研究，且尚未得出明确结论。为了填补这一知识空白，研究人员进行了Meta分析，通过整合临床前研究的所有证据来评估暴露于纳米颗粒是否会显著改变mtDNA含量和mtDNA维持相关基因的水平。结果可能为更好地理解mtDNA损伤在纳米颗粒诱导毒性中的意义提供更好的认识。
2. 2.
   材料与方法
   2.1. 检索策略
   本Meta分析遵循系统综述和Meta分析优先报告条目（PRISMA）2020声明指南。在PubMed、EMBASE和Cochrane Library三个电子数据库中检索2025年7月15日之前发表的潜在合格文章，无语言限制。关键词检索项包括纳米材料和纳米颗粒等相关术语，以及mtDNA拷贝数、线粒体功能障碍、线粒体生物发生、线粒体动力学等相关术语。此外，审查了综述文章和相关原始文章的参考文献列表，以发现可能遗漏的研究。
   2.2. 选择标准
   纳入标准包括：人群为人类、细胞或动物；干预为暴露于纳米颗粒的实验组；比较为未接受纳米颗粒处理的对照组；结局为提供或可估计mtDNA相关指标（包括mtDNA含量和mtDNA编码及维持基因的表达水平）的均值和标准差；研究设计为对照试验。排除标准包括重复、非原创研究、非细胞或动物研究、相关数据不可用、测量指标的研究少于三项、无对照组、粒径大于100 nm或未知、纳米材料作为药物载体治疗疾病而非作为毒性试剂、撤稿或非同行评审以及无关主题。两名作者独立筛选文献以确定合格文章，分歧通过与第三位审稿人协商解决。
   2.3. 数据提取
   两名作者独立提取每篇合格文章的特征相关数据并汇总在Excel表中，包括第一作者、发表年份、研究地点、细胞或动物类型、纳米颗粒类型、尺寸、暴露剂量和持续时间、实验组和对照组样本量、结局数据、数据测定方法和样本组织来源。每个变量的均值和标准差直接从表格/文本中收集或使用GetData Graph Digitizer软件从图中估算。提取每项研究中不同剂量或持续时间测量的数据以评估剂量或时间依赖性效应。数据提取过程中的任何分歧均与第三位审稿人讨论。
   2.4. 质量评估
   纳入的体外和体内研究的方法学质量采用毒理学数据可靠性评估工具（Toxrtool）进行判断。Toxrtool量表包含体外研究18个评估条目和体内研究21个评估标准，每个条目在分析期间评为“1”（符合标准）或“0”（不符合或未报告）。得分超过11分（体外）或13分（体内）的研究被视为可靠。质量评估由两名评估员独立完成；如有差异，则涉及第三名评估员。
   2.5. 统计分析
   将Excel表中的提取数据导出至Stata软件进行数据分析。效应量（ES）表示为标准化均数差（SMD）及95%置信区间（CI）。采用Z统计量分析ES，P_ES值小于0.05表示统计学显著性。使用Cochran's Q卡方检验和I²统计量检查研究间的异质性。异质性（H）定义为P_H小于0.1且I²大于50%。对异质性研究采用随机效应模型进行合并分析，对同质性研究采用固定效应模型。对至少包含十篇文章的变量进行亚组分析，按国家、细胞类型、动物类型、纳米颗粒类型、剂量、暴露持续时间、用于mtDNA含量分析的mtDNA基因、根据测定方法的表达水平（mRNA或蛋白质）以及动物的组织来源分层。此外，还对亚组分析中的指标进行多变量Meta回归分析以探索可能的异质性因素。采用Egger线性回归检验评估发表偏倚（PB）的概率。对存在显著PB（P_PB小于0.05）的变量采用剪补法进行调整。使用留一法进行敏感性分析以衡量合并结果的稳健性。
3. 3.
   结果
   3.1. 研究选择
   三个在线数据库的检索共获得9714条记录。其中5755条因重复被移除。剩余文章经过标题和摘要审查后，排除了3655项研究，原因包括病例报告、综述/Meta分析、会议摘要、信件、方案、非细胞或动物研究、无相关指标、纳米材料作为药物载体或无关主题。全文审查进一步淘汰了74项研究，原因是粒径大于100 nm或未知、数据不可用、无对照组、撤稿、非同行评审或指标测量研究少于三项。最终，230篇文章被纳入定量综合。
   3.2. 研究特征和质量评估
   所有纳入研究的主要特征总结如下。这些研究发表于2009年至2025年，在31个国家开展。在这些研究中使用了各种纳米颗粒，如SiNPs、ZnONPs、AgNPs、TiO₂NPs、FeNPs、PtNPs、Y₂O₃NPs、NiNPs、CuONPs、CeO₂NPs、CoNPs、Al₂O₃NPs、PSNPs、CBNPs、NDs、Ag₂SeQDs、CdTeQDs、GOs和CNTs。它们的暴露剂量或持续时间在研究间存在差异。145篇文章研究了纳米颗粒对正常或癌细胞系的毒性作用，107篇文章进行了体内研究。mtDNA含量通过PCR扩增测定并计算mtDNA/nDNA比率。mtDNA编码基因的mRNA表达水平通过RT-PCR检测，蛋白质表达水平通过WB分析。mtDNA维持基因的表达在mRNA和/或蛋白质水平通过RT-PCR、WB、IHC、ICC、IF或ELISA方法检测。所有研究的Toxrtool评分均大于或等于15，表明均为高方法学质量研究。
   3.3. 体外研究的Meta分析
   从145项体外研究中提取了25个指标的数据。结果显示，与未暴露对照组相比，暴露于纳米颗粒的细胞中mtDNA含量（SMD = ?1.08；P_ES= 0.001）、mtDNA编码基因ND1、COX1、COX2、CYTB和ATP6的表达水平、线粒体生物发生相关基因TFAM、PGC-1α和SIRT1以及线粒体融合相关基因MFN1、MFN2和OPA1均显著降低；而NRF2（总：SMD = 1.69；核：SMD = 1.62；均P_ES小于0.001）、p-AMPK（SMD = 5.54；P_ES小于0.001）、p-AMPK/AMPK（SMD = 5.52；P_ES小于0.001）和线粒体裂变相关基因DRP1（SMD = 1.73；P_ES小于0.001）和p-DRP1（SMD = 2.67；P_ES小于0.001）的表达水平显著增加。纳米颗粒暴露细胞与未暴露细胞之间ND3、NRF1、胞质NRF2、p-NRF2、p-DRP1/DRP1、FIS1和MFF的表达水平无显著差异（P_ES大于0.05）。
   3.4. 体外研究的亚组和Meta回归分析
   由于所分析研究之间存在统计异质性，对至少包含在十篇文章中的指标进行了亚组和Meta回归分析以探索潜在的异质性来源。亚组分析显示，当按颗粒类型、细胞类型等分层时，mtDNA含量、MFN2、OPA1、DRP1、NRF2（总）和核NRF2的异质性似乎被消除，且显著变化与总体Meta分析趋势相似。Meta回归分析揭示国家是DRP1异质性的原因，这间接反映在亚洲国家进行的研究中DRP1表达水平显著升高，而在非亚洲国家则无显著变化。此外，国家和细胞类型被确认为NRF2异质性的贡献者。其他变量的异质性尚不清楚。
   3.5. 体内研究的Meta分析
   从107项体内研究中总共获得了13个指标。在随机效应模型下，汇总分析表明，与未暴露对照组相比，动物模型暴露于纳米颗粒导致TFAM、PGC-1α、NRF2、SIRT1和MFN2的表达水平显著降低，DRP1、p-DRP1和FIS1的表达水平显著增加。动物暴露于纳米颗粒后，mtDNA含量以及核NRF2、MFN1和OPA1的表达水平未发现显著变化。
   3.6. 体内研究的亚组和Meta回归分析
   由于体内研究分析中存在显著异质性，进行了亚组和Meta回归分析。不幸的是，在大多数变量的亚组分析中异质性仍然存在。即使在某些亚组中异质性似乎被消除，但由于样本量非常小或纳入文章数量少，这一结论需要进一步确认。Meta回归分析也未确定四个指标中异质性的来源。然而，与总体Meta分析结果一致，在暴露于不同纳米颗粒的动物肺、脑、心和睾丸组织中，PGC-1α、NRF2、MFN2和FIS1的表达水平显示出显著上调或下调。有趣的是，MFN2的表达在mRNA和蛋白质水平均被纳米颗粒暴露显著抑制，而PGC-1α、DRP1、NRF2和FIS1的表达仅在mRNA或蛋白质水平发生改变。这些发现表明MFN2可能是解释纳米颗粒诱导动物毒性的特别重要的靶标。
   3.7. 发表偏倚和敏感性分析
   Egger线性回归检验结果显示大多数结局的分析存在显著偏倚。对具有显著PB的变量进行了剪补校正分析。结果表明，校正后mtDNA含量以及多个基因表达的ES未发生显著变化。敏感性分析显示逐一剔除每项研究对总体结果没有显著影响，支持了结果的稳定性和可靠性。
4. 4.
   讨论
   最近有两项研究使用Meta分析方法探讨环境污染物对人类mtDNA含量的影响，主要关注大颗粒态重金属和空气动力学直径小于2.5或10 μm的颗粒物，其汇总结果表明上述较大粒径的环境污染物对mtDNA含量无显著影响。考虑到纳米颗粒比其大块对应物具有更高的毒理学效应，mtDNA被认为更容易受到纳米颗粒诱导的损伤。这与本研究结果一致，即细胞暴露于纳米颗粒后mtDNA含量显著降低，证明了环境颗粒对mtDNA的毒性效应具有尺寸依赖性。此外，mtDNA编码基因的表达水平也被发现显著抑制，这可能解释了纳米颗粒导致的线粒体电子传递链损伤和线粒体功能障碍。理论上，AMPK/SIRT1-PGC-1α-NRF1/2-TFAM信号通路可能受纳米颗粒影响而下调，该假设在体外和体内研究的Meta分析中得到证实，即SIRT1、PGC-1α和TFAM显著减少。然而，NRF2在体内和体外研究中结果不一致，可能与纳入的纳米颗粒类型不同以及NRF2在抗氧化应激中的保护作用有关。p-AMPK和p-AMPK/AMPK显著升高，这可能与AMPK参与多种信号通路（如AMPK/mTOR）有关。NRF1水平未发现显著改变，可能是由于纳入研究数量较少。线粒体动力学标志物MFN1、MFN2和OPA1显著抑制，而DRP1显著增加，这与先前研究相符。FIS1仅在体内研究Meta分析中显示显著变化，但纳入文章较少，结论尚不确定。本研究存在一些局限性，包括某些纳米颗粒或特定细胞/器官的亚组分析纳入研究较少、多数出版物来自亚洲国家、缺乏临床研究验证mtDNA相关指标作为职业暴露生物标志物的转化价值、未检测其他mtDNA维持基因（如POLG等）、从图表提取数据可能存在偏差、异质性较强且部分来源未确定，以及需要探索更具体的上游机制。
5. 5.
   结论
   本全面的Meta分析表明，纳米颗粒对细胞或动物组织的暴露导致mtDNA含量显著减少，mtDNA编码基因（ND1、COX1、COX2、CYTB和ATP6）的表达模式改变（下调），以及介导mtDNA维持的主要调控基因（生物发生：SIRT1/PGC-1α/TFAM，下调；融合：MFN1/MFN2/OPA1，下调；裂变：DRP1/FIS1，上调）的表达改变。研究结果可能为监测职业工人暴露于纳米颗粒的氧化损伤提供潜在的生物标志物，并为开发减轻有害效应的策略提供分子靶点，尽管还需要进一步的临床前和临床研究来验证这一假设。