P物质调控Tacr1神经元介导小鼠皮层一氧化氮依赖性神经血管耦合

《SCIENCE ADVANCES》：Substance P regulates Tacr1 neurons, which control nitric oxide–mediated neurovascular coupling in the mouse cortex

　　

神经元活动驱动的脑血流量（cerebral blood flow, CBF）增加，即神经血管耦合（neurovascular coupling, NVC），对于维持脑的代谢需求至关重要。研究人员此前发现，Tacr1神经元——表达P物质（substance P, SP）受体和神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）的生长抑素（somatostatin, SST）神经元亚群——对CBF具有不成比例的显著调控作用。本研究利用双光子（two-photon, 2P）成像技术证明，Tacr1神经元通过一氧化氮（nitric oxide, NO）释放和SP受体信号调控CBF。研究人员将星形胶质细胞钙（Ca²⁺）瞬变鉴定为血管舒张的继发性反应。为确定躯体感觉皮层中SP的潜在来源，病毒示踪显示Tac1阳性神经元主要存在于局部parvalbumin（PV）神经元中，同时发现来自嗅周皮层（perirhinal cortex）的Tac1阳性长程投射。功能分析表明，PV神经元通过Tacr1神经元依赖性通路调控CBF。这些发现揭示了一种顺序机制：Tacr1神经元响应SP而释放NO，诱导血管舒张并驱动星形胶质细胞Ca²⁺信号。

该研究旨在阐明稀疏分布的Tacr1神经元如何通过NO介导的信号通路调控神经血管耦合，并解析SP信号在该环路中的作用，为理解神经血管功能障碍的治疗提供新思路。

神经元活动需要血液持续精确地供应氧气和葡萄糖，因其缺乏大量能量储备且厌氧代谢能力有限。为满足局部代谢需求，神经元活动通过精细调控的NVC过程诱导CBF变化。NVC障碍与多种神经退行性疾病相关，如阿尔茨海默病中神经活动与CBF的长期失匹配可能导致进行性神经元损伤。NVU由神经元、星形胶质细胞、内皮细胞及壁细胞（包括血管平滑肌细胞和周细胞）组成。皮质抑制性神经元中表达nNOS的神经元被视为CBF调控的关键，因其可释放强效血管舒张因子NO。Tacr1神经元作为nNOS神经元亚型，具有高nNOS表达和长程轴突投射特征，虽仅占皮质抑制性神经元的2%，却是CBF调控的关键介导者。光遗传学激活极少量Tacr1神经元即可显著增加局部血流量，而其抑制则显著减弱胡须刺激引发的功能性充血。Tacr1神经元与星形胶质细胞终足形成直接联系，提示其可能直接调控星形胶质细胞活动。先前研究关于星形胶质细胞Ca²⁺与血管变化的关系存在争议，本研究利用选择性激活Tacr1神经元这一稀疏群体充分诱导血管舒张的特性，重新评估神经元、血管舒张与星形胶质细胞Ca²⁺瞬变之间的关系。

此外，Tacr1神经元的定义性特征是其Tacr1表达。研究表明SP可去极化皮质Tacr1神经元，且光遗传学激活这些神经元足以驱动血管舒张。本研究结合光遗传学刺激、在体双光子Ca²⁺成像、激光多普勒血流测量（laser Doppler flowmetry, LDF）、SP受体药理学操作及体外实验，验证SP调控Tacr1神经元活动导致血管舒张并通过NO释放发挥作用的假说，并确定调控Tacr1神经元活性的皮质SP潜在来源。

研究首先验证Tacr1神经元通过NO依赖性机制增加CBF。研究人员通过将Tacr1^CreER小鼠与Ai32小鼠杂交获得Tacr1^CreER-ChR2-YFP小鼠，于S1皮层植入慢性给药套管，在清醒头部固定小鼠中使用LDF测量CBF。选择性nNOS抑制剂L-NPA使胡须刺激诱发的CBF变化降低38%，表明NO在感觉诱发NVC中发挥重要作用。光遗传学激活Tacr1神经元（1 mW, 1 s, 5 Hz）的同时测量CBF变化，L-NPA显著减弱该CBF增加达40%；非选择性NOS抑制剂L-NAME同样减少33%的Tacr1神经元诱发CBF变化。急性实验中，L-NPA直接皮层注射使Tacr1神经元刺激诱导的CBF增加被抑制58%，内源光学成像确认注射部位附近血流动力学反应的局部抑制。无论慢性或急性实验、清醒或轻度镇静状态、LDF或内源光学成像记录，nNOS抑制均一致减弱Tacr1神经元激活的CBF反应，表明NO信号在Tacr1神经元介导的NVC中发挥重要作用。

研究接着探讨Tacr1神经元激活触发延迟的星形胶质细胞Ca²⁺反应。既往研究显示血管舒张伴随星形胶质细胞Ca²⁺瞬变增加，但二者关系尚存争议。研究人员在Tacr1^CreER-ChR2-YFP小鼠S1皮层注射星形胶质细胞特异性AAV5-gfaABC1D-cyto-GCaMP6f，表达Ca²⁺指示剂GCaMP6f，在清醒头部固定小鼠中进行2P成像，同步监测星形胶质细胞Ca²⁺动态和血流动力学变化。胡须刺激（50 ms空气脉冲，5 Hz，1 s）诱发动脉快速舒张后继以延迟的星形胶质细胞Ca²⁺反应，平均动脉舒张17%，星形胶质细胞Ca²⁺峰值增加15%。光遗传学激活Tacr1神经元同样导致血管舒张后继以延迟的星形胶质细胞Ca²⁺瞬变，平均动脉舒张13%，星形胶质细胞Ca²⁺峰值增加12%。延长刺激持续时间至10 s使血管舒张延长，但星形胶质细胞Ca²⁺瞬变的时间点始终与血管收缩期相匹配，提示这些Ca²⁺瞬变可能是血管收缩的结果。静脉注射内皮型NO合酶（endothelial NO synthase, eNOS）抑制剂L-NIO以阻止内皮细胞血管舒张而不影响Tacr1神经元的NO释放，L-NIO显著降低胡须刺激和Tacr1神经元光遗传学激活期间的星形胶质细胞Ca²⁺反应，表明星形胶质细胞Ca²⁺瞬变可能依赖于血管舒张-收缩序列而非Tacr1神经元的直接输入。

研究进一步验证Tacr1神经元活动受SP调控。研究人员在清醒头部固定的Tacr1^CreER-GCaMP6f小鼠中使用2P Ca²⁺成像结合慢性套管给药。SP输注使Tacr1神经元活动显著增加，Ca²⁺峰值每分钟增加约198%，相邻动脉平均血管直径增加12%；而载体输注无显著变化。SP受体拮抗剂CP-9994输注将内源性Tacr1神经元活动降低约49%，但不改变平均血管直径，凸显内源性SP信号在调控Tacr1神经元活动中的关键作用。CP-9994还将胡须刺激诱发的Tacr1神经元活动增加从46%降至27%，动脉血管直径增加从23%降至18%，LDF测量显示胡须诱发CBF反应降低27%。这些发现表明内源性SP信号调控自发性和诱发性Tacr1神经元活动，进而影响CBF。

研究进而探究皮质中SP的来源。通过向Tac1^Cre小鼠S1注射Cre依赖性逆行AAVrg-FLEX-tdTomato，发现广泛报告基因标记，提示局部Tac1阳性神经元可能贡献SP释放。免疫组化显示43%的tdT标记神经元为PV阳性；多重心荧光原位杂交（multiplex fluorescence in situ hybridization, FISH）显示33%的Pvalb阳性神经元共表达Tac1，55%的Tac1阳性细胞为Pvalb阳性，而几乎无Tac1阳性神经元为兴奋性神经元（SLC17A6阳性）。双侧注射实验显示，长程投射Tac1阳性神经元仅见于嗅周皮层，约40%来自同侧S1，45%来自对侧S1，15%的嗅周皮层神经元向双侧S1投射。这些长程投射也表达PV（34%），提示其投射广泛分布于整个皮层。

研究最后验证PV神经元诱导的CBF增加需要SP信号和NO释放。在Pvalb^Cre小鼠S1表达Cre依赖性ChR2，光遗传学刺激（40 Hz, 10 s）同时记录CBF。CP-9994使PV诱发CBF反应从33%降至14%，L-NPA使其从37%降至11%，而载体无影响。这些结果表明PV介导的血流变化由SP介导，且PV神经元激活招募了与Tacr1神经元激活一致的信号级联，导致NO介导的血管舒张。

研究总结指出，尽管稀疏分布，Tacr1神经元是NVC的关键介导者。Tacr1神经元通过NO释放调控CBF增加，其激活导致血管舒张后继以延迟的星形胶质细胞Ca²⁺活动。SP从局部PV神经元释放调控Tacr1神经元活性，长程Tac1阳性投射来自嗅周皮层，可能参与调控不同脑状态下的Tacr1神经元活动。Tacr1神经元整合了皮质-皮质和丘脑-皮质输入，处于兴奋性和神经调质性信号交汇的战略位置，能够预测和协调局部代谢需求。该研究建立了一个细胞机制：Tacr1神经元受SP受体调控，通过NO释放介导CBF；星形胶质细胞Ca²⁺瞬变发生于Tacr1神经元活动引发的血管舒张之后；PV神经元亚群表达Tac1并通过Tacr1神经元依赖性NO信号激活通路介导CBF。这些发现确立了Tacr1神经元作为连接神经信号至血管和星形胶质细胞Ca²⁺动态的关键 intermediary（中间神经元），定义了神经肽能调控如何塑造脑血管功能的环路水平框架。该论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。