单细胞转录组分析揭示甲状腺癌淋巴结定植与进展的肿瘤免疫决定因素

《SCIENCE ADVANCES》：Single-cell transcriptomic analysis reveals tumor-immune determinants of lymph node colonization and progression in thyroid cancer

　　

淋巴结转移是包括甲状腺癌在内的实体癌死亡率的主要驱动因素。为了阐明淋巴结播散的决定因素，研究人员从原发性甲状腺肿瘤及其匹配的转移性淋巴结中分离出肿瘤浸润白细胞，进行单细胞RNA测序，并通过多重免疫组织化学进行验证。比较原发肿瘤与其淋巴结之间的微环境改变，研究人员发现，甲状腺细胞和肿瘤相关巨噬细胞在淋巴结定植时下调了多种炎症细胞因子受体的表达，包括肿瘤坏死因子受体超家族成员12A和CX3C趋化因子受体1。与匹配的原发肿瘤相比，淋巴结与调节性T细胞的诱导相关，以抑制T细胞介导的细胞毒性。值得注意的是，淋巴结内的肿瘤浸润淋巴细胞表现出激活标志物表达增加，包括白细胞介素7受体。淋巴结中白细胞介素7受体的高表达与改善的预后显著相关，并可作为这种异质性疾病的一个生物标志物。研究人员关于淋巴结转移内动态平衡的发现可能为实体瘤的淋巴结定植提供保守的机制。

**甲状腺癌淋巴结转移的微环境决定因素：单细胞转录组学解读**

**研究背景与意义**
淋巴结转移是实体癌（包括甲状腺癌）死亡率的主要驱动因素。甲状腺癌，尤其是甲状腺乳头状癌，表现出极高的区域淋巴结定植倾向，手术中需要进行广泛的淋巴结清扫，并常辅以放射性碘等治疗以清除微转移灶。尽管采取了这些积极措施，仍有一部分淋巴结阳性的甲状腺癌患者会复发。过去三十年间，甲状腺恶性肿瘤的发病率几乎增加了两倍，现已成为青少年和年轻成人中最常见的恶性肿瘤。因此，理解这些肿瘤如何从原发部位高效迁移至区域组织，以及这种迁移如何影响预后，变得至关重要。甲状腺乳头状癌的预后谱系广泛，从高度惰性疾病到具有超过20%复发风险的侵袭性高危疾病不等。组织学亚型也带来不同程度的风险。尽管大规模测序研究已揭示了甲状腺乳头状癌中的多种互斥突变，但这种方法整合了不同细胞类型的表达，可能模糊了肿瘤成分之间的关键区别。因此，有必要利用单细胞分辨率的高维肿瘤谱分析，以淋巴结为中心的疾病为模型，识别甲状腺癌疾病进展的新生物标志物。

**主要技术方法**
本研究整合了单细胞RNA测序和功能分析，以识别促进淋巴结转移和疾病进展的免疫特征。研究人员收集了5例淋巴结阳性甲状腺癌患者的配对原发肿瘤和转移性淋巴结样本，进行肿瘤微环境的单细胞RNA测序。为了富集分析，在构建单细胞RNA测序文库前，先对CD45⁺肿瘤浸润白细胞进行了分选。数据分析采用无监督聚类和统一流形逼近与投影等方法。研究结果在一个独立的验证队列（21例淋巴结阳性经典型甲状腺乳头状癌患者）中，通过多重免疫组织化学技术对选定的免疫靶点进行了验证，并与肿瘤学结局进行了相关性分析。

**研究结果**

**1. 配对甲状腺肿瘤和转移性淋巴结的单细胞RNA测序**
通过分析31,026个细胞和9,700个基因，研究人员鉴定了六个主要细胞群：髓系细胞、T/自然杀伤细胞、B/浆细胞、甲状腺癌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。CD45⁺肿瘤浸润白细胞是主要的捕获细胞类型，约占所有细胞的80%。与原发肿瘤相比，淋巴结样本中更频繁地鉴定出T/自然杀伤细胞，而髓系细胞则更常见于原发肿瘤样本，提示这两个疾病部位的免疫组成存在潜在差异。

**2. 转移性淋巴结中甲状腺癌细胞的免疫逃逸**
研究人员分析了单细胞RNA测序捕获的2,681个甲状腺癌细胞。研究发现，甲状腺癌细胞高表达多种肿瘤坏死因子受体超家族基因。其中，TNFRSF12A（肿瘤坏死因子受体超家族成员12A）在原发肿瘤和淋巴结中均与甲状腺癌的总生存期显著相关。通过比较癌症基因组图谱中TNFRSF12A高表达和低表达的甲状腺癌，发现TNFRSF12A高表达的肿瘤上调了与细胞外重塑、侵袭和细胞因子驱动的炎症相关的基因和通路。多重免疫组织化学验证显示，与原发肿瘤细胞相比，转移性淋巴结中的PAX8⁺甲状腺癌细胞数量更少，且表达的TNFRSF12A显著降低。这表明甲状腺肿瘤细胞可能下调TNFRSF12A等肿瘤坏死因子受体超家族成员的表达，以避免在远处部位因肿瘤坏死因子信号传导而凋亡。

**3. 甲状腺癌的先天免疫功能障碍与结局**
研究人员比较了原发甲状腺癌和转移性淋巴结之间的免疫微环境差异。通过单细胞RNA测序数据的亚群分析，鉴定了六个髓系细胞簇：脂质相关肿瘤相关巨噬细胞、免疫调节性肿瘤相关巨噬细胞、驻留组织巨噬细胞样肿瘤相关巨噬细胞、CD14⁺CD16^low单核细胞、经典树突状细胞和浆细胞样树突状细胞。与原发肿瘤相比，淋巴结中经典和浆细胞样树突状细胞富集。差异基因表达分析发现，原发肿瘤中的髓系细胞（特别是脂质相关肿瘤相关巨噬细胞）上调了包括CX3C趋化因子受体1在内的多个基因表达。癌症基因组图谱数据分析显示，无淋巴结转移的局部甲状腺癌中CX3C趋化因子受体1表达增加，且CX3C趋化因子受体1和载脂蛋白C1的高表达与甲状腺癌患者的总生存期正相关。

**4. 调节性T细胞促进转移性淋巴结内的免疫抑制**
研究人员对单细胞RNA测序捕获的16,760个肿瘤浸润淋巴细胞进行了亚群分析，鉴定了六个亚型：B细胞、浆细胞、自然杀伤细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、混合T细胞和调节性T细胞。肿瘤浸润淋巴细胞亚型的组成在原发肿瘤和转移性淋巴结之间存在差异。调节性T细胞和混合T细胞在淋巴结转移中富集。多重免疫组织化学验证显示，与原发肿瘤相比，转移性淋巴结中叉头框蛋白P3（调节性T细胞的经典标志物）染色增加。癌症基因组图谱数据表明，淋巴结阳性甲状腺癌中叉头框蛋白P3的表达显著高于局部淋巴结阴性疾病，且在淋巴结阳性患者中，叉头框蛋白P3高表达与较差的生存结局相关。这些数据表明调节性T细胞可能通过局部淋巴结微环境并抑制原发肿瘤内的免疫反应来促进淋巴结转移。

**5. 通过白细胞介素7受体进行的免疫激活可预测甲状腺癌结局**
研究人员比较了疾病部位之间肿瘤浸润淋巴细胞的整体转录谱，发现淋巴结肿瘤浸润淋巴细胞中白细胞介素7受体在转录和蛋白水平均上调。单细胞RNA测序数据显示，白细胞介素7受体在CD4⁺ T细胞和混合T细胞上表达。多重免疫组织化学验证证实，验证队列中淋巴结转移内的白细胞介素7受体表达细胞较原发肿瘤增加。在验证队列中，比较了无疾病证据患者与有疾病进展或死亡记录患者的淋巴结转移内白细胞介素7受体染色水平，发现无疾病证据患者组的淋巴结白细胞介素7受体表达水平显著更高。淋巴结白细胞介素7受体表达最高四分位数组患者的无进展生存期显著延长，且达到100%无进展生存率。相比之下，原发肿瘤中的白细胞介素7受体表达或淋巴结内的其他免疫标志物在该队列中无法预测结局。

**讨论与结论**
本研究通过单细胞分辨率的高维肿瘤谱分析，定义了允许甲状腺癌有效定植远处转移性淋巴结的微环境改变。对甲状腺癌肿瘤微环境的评估揭示了多个与大型人群队列结局预后相关的肿瘤内在和外在特征。研究意外地发现白细胞介素7受体是一个淋巴结特异性生物标志物，可预测复发风险，可能更好地对淋巴结转移患者进行分层。研究首先试图识别原发肿瘤和肿瘤引流淋巴结之间的肿瘤内在差异。研究发现，与原发肿瘤相比，甲状腺细胞在淋巴结转移中显著下调了肿瘤坏死因子受体超家族成员TNFRSF12A的表达。由于肿瘤坏死因子信号传导可诱导甲状腺癌细胞凋亡，迁移至淋巴结时TNFRSF12A的缺失可能使甲状腺乳头状癌对淋巴结微环境内局部产生的肿瘤坏死因子细胞因子脱敏。随后，研究人员通过富集肿瘤浸润白细胞，关注了配对原发肿瘤和转移性淋巴结之间的肿瘤外在差异。先天免疫细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞，在原发肿瘤中比在转移性淋巴结中更占优势。分析揭示了表达脂质代谢多个标志物的脂质相关肿瘤相关巨噬细胞在原发肿瘤中富集，这可能起到隔离原发部位的作用。此外，研究发现原发肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞内的炎症细胞因子受体CX3C趋化因子受体1表达上调。CX3C趋化因子受体1和脂质相关肿瘤相关巨噬细胞的标志物载脂蛋白C1与甲状腺癌的生存显著相关。数据表明，转移性淋巴结内的微环境存在于免疫抑制和免疫激活元素之间的精细平衡中。考虑到调节性T细胞的抑制活性，原发肿瘤内调节性T细胞经典标志物叉头框蛋白P3的高水平与局部晚期甲状腺乳头状癌和较差长期总生存期相关并不意外。然而，通过单细胞RNA测序和多重免疫组织化学，研究人员发现调节性T细胞在转移性淋巴结中较匹配的原发肿瘤显著且进一步富集。这一发现表明原发肿瘤和淋巴结之间的T细胞景观存在巨大差异，甲状腺乳头状癌可能利用调节性T细胞的抑制能力来定植远处淋巴结的敌对微环境。研究人员随后比较了疾病部位之间肿瘤浸润淋巴细胞的整体转录景观，并在肿瘤引流淋巴结的转录和蛋白水平上发现了白细胞介素7受体的上调。鉴于白细胞介素7受体对于T细胞发育、存活和稳态至关重要，并且与其他实体瘤的改善结局相关，研究发现转移性淋巴结中白细胞介素7受体的表达在一个局部晚期甲状腺乳头状癌患者队列中高度预示肿瘤学结局。淋巴结白细胞介素7受体表达最高四分位数的患者表现出100%的无进展生存率。这一发现与肿瘤引流淋巴结中肿瘤特异性T细胞高表达白细胞介素7受体的观察结果一致。因此，通过白细胞介素7受体进行的T细胞激活和稳态可能抵消肿瘤引流淋巴结肿瘤微环境中调节性T细胞的免疫抑制能力。淋巴结转移是包括甲状腺乳头状癌在内的实体癌死亡率的主要驱动因素。然而，淋巴结阳性甲状腺乳头状癌患者的结局范围广泛，从惰性疾病到快速复发不等，最初的分子策略收效不一。识别不良因素将优化治疗策略，同时提供基于证据的保证。放射性碘通常用于复发或死亡风险较高的晚期病例，但鉴于其不良副作用，关于其适应症和剂量存在重大争议。不断发展的国家指南建议考虑对超过5个转移性淋巴结或淋巴结大小大于3厘米的患者使用放射性碘，但这是一种粗略的衡量标准，需要进一步细化，以避免过度治疗患者并为微小的生存获益造成不必要的毒性。因此，临床上迫切需要更好地识别疾病进展高风险患者。包括癌症基因组图谱在内的大型人群数据库提供了有关甲状腺乳头状癌基因组景观及临床病理相关性的宝贵数据；然而，这些研究中的转录数据通常来自原发肿瘤，关于淋巴结转移转录状态的数据很少甚至没有。据研究人员所知，本研究首次利用单细胞转录组学识别出一个淋巴结特异性生物标志物，该标志物可预测甲状腺乳头状癌的结局。基于研究数据，评估白细胞介素7受体的表达可能用于识别患有更具侵袭性疾病且适合强化治疗的患者。鉴于原发肿瘤和肿瘤引流淋巴结之间的免疫景观存在巨大差异，有必要探查远处淋巴结的局部微环境，以更好地预测甲状腺乳头状癌的结局。这些数据支持在更大规模的前瞻性队列中研究白细胞介素7受体作为预后生物标志物，及其驱动治疗降级的预测能力。

**研究结论**
本研究利用单细胞转录组学识别了促进甲状腺癌淋巴结定植的免疫和非免疫特征。研究不仅提供了原发肿瘤和转移性淋巴结之间微环境改变的综合图谱，还确定了一个淋巴结特异性生物标志物，该标志物对这种高度异质性疾病的肿瘤学结局具有预后价值。研究数据进一步揭示了甲状腺乳头状癌如何定植远处部位的机制，并对治疗干预具有启示意义。