《SCIENCE ADVANCES》：Cyclin K condensates bridge CDK12 to phosphorylate and drive oncogenic YAP activation in hepatocellular carcinoma
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靶向转录凝聚体是癌症治疗的新兴范式。一个关键角色是转录共激活因子YAP（Yes相关蛋白），它驱动促进肿瘤进展和治疗抵抗的肿瘤特异性程序。与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）CDK12/CDK13配对的Cyclin K（细胞周期蛋白K）对于转录延伸至关重要，但其在
靶向转录凝聚体是癌症治疗的新兴范式。一个关键角色是转录共激活因子YAP（Yes相关蛋白），它驱动促进肿瘤进展和治疗抵抗的肿瘤特异性程序。与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）CDK12/CDK13配对的Cyclin K（细胞周期蛋白K）对于转录延伸至关重要，但其在特定致癌程序中的作用尚不清楚。本研究确定Cyclin K是跨多种癌症类型的关键脆弱性。CDK12/Cyclin K复合物通过Cyclin K与YAP结合，并形成调节性凝聚体以桥接CDK12对YAP的磷酸化。这种在苏氨酸-398位点的磷酸化阻碍了其经典LATS激酶对YAP的抑制，稳定了YAP，并使其能够与TEAD4进一步凝聚，从而刺激YAP的致癌活性。CDK12/Cyclin K和YAP的共表达预测了肝细胞癌细胞和患者来源的异种移植物对Cyclin K抑制剂的敏感性。因此，研究人员将CDK12/Cyclin K定义为YAP驱动的转录成瘾的关键调节因子，并作为患者分层的生物标志物，这些患者最可能从靶向CDK12/Cyclin K–YAP轴的疗法中获益。
**研究背景与意义**
转录失调是癌症的基本特征，肝细胞癌也不例外。转录共激活因子YAP的过度激活是许多癌症的标志，它通过结合TEA域转录因子驱动肿瘤特异性转录程序，促进肿瘤进展和治疗抵抗。然而，YAP本身作为转录共激活因子，其成药性有限，因此筛选其邻近调控因子成为开发癌症治疗的新策略。与此同时，由液-液相分离形成的生物分子凝聚体在组织RNA聚合酶II（Pol II）转录机制以实现选择性基因调控方面发挥着日益重要的作用。Cyclin K是转录细胞周期蛋白家族的新成员，与激酶CDK12和CDK13形成功能复合物，在转录延伸和DNA损伤应答中起关键作用。尽管CDK12/13已被广泛研究，但Cyclin K除了作为结合伙伴之外的作用在很大程度上仍未探索。发表在《SCIENCE ADVANCES》上的这项研究，旨在揭示Cyclin K在特定致癌程序，特别是YAP信号通路中的功能，并探索其作为治疗靶点的潜力。
**主要技术方法**
研究人员综合利用了多种技术手段。首先，利用CRISPR和RNA干扰（RNAi）筛选数据、公共转录组和蛋白质组数据库（如DepMap、TCGA、CPTAC）以及临床样本队列（包括1624例HCC样本和1112例非肿瘤肝样本），分析了CCNK在多种癌症，特别是肝细胞癌中的表达、预后意义和细胞存活依赖性。其次，通过免疫共沉淀、质谱分析、GST pull-down实验和截短突变体构建，确定了CDK12/Cyclin K与YAP之间的物理相互作用及其关键结构域（Cyclin K的C端PPxY基序和YAP的WW结构域）。第三，利用重组蛋白进行体外液-液相分离实验，并通过活细胞成像、荧光漂白恢复技术，证实了Cyclin K、CDK12和YAP形成动态的、具有液体性质的核内生物分子凝聚体的能力。第四，通过体外激酶实验、质谱鉴定和位点特异性突变，确定了CDK12在T398位点直接磷酸化YAP。第五，利用报告基因检测、染色质免疫沉淀、qPCR、免疫荧光、细胞分馏和免疫印迹等技术，系统评估了CDK12/Cyclin K对YAP亚细胞定位、稳定性、与LATS激酶/TEAD4的相互作用以及下游靶基因转录活性的影响。最后，通过细胞活力检测、克隆形成实验、异种移植瘤模型和患者来源的异种移植模型，评估了靶向Cyclin K的药理学抑制剂的治疗效果，并基于CDK12/Cyclin K与YAP的共表达水平进行了生物标志物驱动的敏感性分析。
**研究结果**
**1. Cyclin K高表达与HCC进展相关**
研究人员分析发现，CCNK在多种癌症类型中广泛不可或缺，并且在肝细胞癌组织中mRNA和蛋白水平均显著过表达，与患者不良预后相关。遗传学敲低CCNK或药理学抑制Cyclin K/CDK12均能广泛抑制HCC细胞活力和体内肿瘤生长，确立了CCNK在包括肝癌在内的多种癌症中的关键脆弱性。
**2. Cyclin K在HCC中刺激YAP信号通路**
基因集富集分析显示，在Cyclin K或CDK12高表达的HCC样本中，YAP信号通路富集。CCNK或CDK12的缺失导致YAP核排斥、磷酸化水平改变、总蛋白量减少以及下游靶基因（如
CYR61、
CTGF、
ANKRD1）表达下调，同时增强YAP与14-3-3的相互作用和泛素化降解。相反，过表达CCNK或CDK12则促进YAP核滞留和激活。临床数据分析显示，CCNK表达与YAP及其靶基因表达呈显著正相关，免疫组化也证实了Cyclin K与YAP在HCC组织中的共表达。
**3. CDK12/Cyclin K通过PPxY基序与YAP结合**
免疫共沉淀和质谱分析将YAP鉴定为Cyclin K的结合伙伴。实验证实YAP、Cyclin K和CDK12能形成复合物，并在细胞核内共定位。相互作用域图谱显示，YAP的WW结构域和Cyclin K C端区域（包含两个保守的PPxY基序）介导了二者的结合。突变PPxY基序会完全破坏Cyclin K与YAP的结合，并削弱Cyclin K介导的YAP去磷酸化、稳定化、核滞留和转录活性。体内实验也表明，表达PPxY双突变体的异种移植瘤生长显著减缓。此外，Cyclin K也能通过类似机制调节YAP的同源蛋白TAZ。
**4. CDK12/Cyclin K与YAP发生相分离**
生物信息学预测显示Cyclin K和CDK12均含有广泛的内在无序区。体外实验证实纯化的Cyclin K蛋白能形成动态的液体样液滴。在细胞中，内源性Cyclin K和CDK12能在渗透压刺激下形成核内凝聚体，并表现出融合和荧光恢复特性。Cyclin K、CDK12和YAP能相互招募并共定位于核内凝聚体中。Cyclin K的缺失会导致YAP被排除在CDK12凝聚体之外，表明Cyclin K介导了CDK12/YAP凝聚体的形成。
**5. CDK12/Cyclin K复合物磷酸化YAP苏氨酸-398位点**
CDK12敲除或药理学抑制会降低YAP的整体磷酸化水平，而过表达CDK12则增加其磷酸化。体外激酶实验结合质谱分析鉴定出CDK12/Cyclin K直接磷酸化YAP的T398位点。T398位点的磷酸化模拟突变体（T398E）能更有效地激活YAP转录活性、促进其核定位、增强与Cyclin K及TEAD4的结合，并更有效地被招募到Cyclin K凝聚体中。体内外功能实验表明，YAP-T398E比野生型YAP具有更强的促增殖和促瘤能力，而磷酸化缺陷突变体（T398A）则失去此能力。进一步研究发现，Cyclin K形成凝聚体的能力（依赖于其内在无序区）及其与YAP的结合能力（依赖于PPxY基序）对于介导YAP T398磷酸化和激活都是必需的。
**6. CDK12/Cyclin K与LATS激酶竞争YAP磷酸化**
YAP通常被经典LATS激酶在多个位点（包括与T398相邻的S397）磷酸化而抑制。研究发现，Cyclin K缺失会增加YAP S397的磷酸化。YAP-T398A与LATS激酶的结合更强，而YAP-T398E则结合较弱。CDK12或Cyclin K的过表达会削弱YAP与LATS激酶的相互作用，同时增强YAP与TEAD4的结合。相反，LATS激酶过表达会减少YAP与CDK12/Cyclin K的共免疫沉淀。Cyclin K抑制剂SR-4835处理则呈现剂量依赖性地增强YAP-LATS结合并减弱YAP-TEAD4结合。在临床样本中，肿瘤组织内YAP更倾向于与CDK12共定位，而在癌旁正常组织中则更倾向于与LATS1共定位。这些结果表明CDK12/Cyclin K通过对T398的磷酸化，在空间上阻碍了LATS激酶对YAP的抑制性磷酸化，形成一种竞争性“拉锯战”机制，从而决定YAP的活性和命运。
**7. YAP信号通路转录激活CDK12/Cyclin K**
研究人员在CCNK和CDK12的启动子区发现了潜在的YAP/TEAD结合基序。实验证实YAP过表达能上调CCNK及其经典靶基因的表达，而敲低YAP/TAZ或TEAD则会降低CCNK表达。染色质免疫沉淀和报告基因实验证明TEAD4直接结合CCNK启动子并驱动其转录。这揭示了一个正反馈环路：YAP/TEAD转录上调CCNK，进而通过CDK12/Cyclin K增强YAP活性，从而放大YAP信号以响应致癌线索。
**8. 靶向Cyclin K治疗CDK12/Cyclin K–YAP信号轴成瘾的HCC**
功能实验表明YAP是致癌性CDK12/Cyclin K信号通路的关键下游效应器。对肝癌细胞系的分析显示，CDK12/Cyclin K与YAP表达呈强正相关。研究人员根据CDK12/Cyclin K和YAP的共表达水平对HCC细胞系进行分层，发现高共表达的细胞（如CLC40和SNU398）对一系列Cyclin K分子胶降解剂（包括SR-4835）表现出更高的敏感性。在患者来源的异种移植模型中，高表达CDK12、Cyclin K和YAP的PDX-3模型对SR-4835治疗反应显著，而低共表达的PDX-1模型则反应有限。机制上，YAP-T398E突变导致对Cyclin K抑制剂产生抵抗，而YAP-T398A则无此效应，且已知的YAP-TEAD相互作用抑制剂维替泊芬能减弱细胞对SR-4835的敏感性，表明治疗效果依赖于完整的CCNK/YAP-TEAD信号轴。
**讨论与结论**
本研究揭示了CDK12/Cyclin K复合物通过整合酶活性和生物分子凝聚，精细调控YAP信号和转录输出的新机制。Cyclin K在多种癌症中的广泛必需性及其在HCC中的异常高表达，使其成为预后生物标志物和治疗脆弱点。机制上，CDK12/Cyclin K通过液-液相分离形成生物分子凝聚体，作为调节枢纽。在该枢纽内，CDK12直接磷酸化YAP的T398位点，而Cyclin K对于桥接CDK12与YAP的相互作用至关重要。这种磷酸化在空间上阻碍了LATS激酶对YAP的抑制性磷酸化，稳定了YAP并促进其与TEAD4形成致癌性凝聚体，从而激活靶基因。YAP/TEAD反过来转录上调CCNK，形成正反馈环路，放大信号。基于CDK12/Cyclin K与YAP共表达的分层，能够预测HCC细胞和PDX模型对Cyclin K抑制剂的敏感性，为靶向该通路的精准治疗提供了概念验证和生物标志物策略。
**研究结论部分翻译：**
总之，这项研究重新定义了CDK12/Cyclin K复合物作为一个关键的致癌回路，它利用相分离和竞争性磷酸化来过度激活YAP信号，从而产生治疗脆弱性，确立了CDK12/Cyclin K作为分子定义HCC亚型的一个有前景的治疗靶点。
