亚临界水萃取技术对葡萄皮渣进行分馏以获取功能性成分的研究

《Applied Sciences》：Applying Subcritical Water Extraction to Fractionate Grape Pomace into Functional Ingredients

　　

葡萄皮渣（Grape Pomace, GP）是酿酒工艺的主要残留物，富含具有显著生物活性的酚类化合物。本研究将亚临界水萃取（Subcritical Water Extraction, SWE）技术应用于GP，分别在120、140和160 °C条件下进行分馏以获得高附加值产品。在120 °C和1.3 bar条件下进行的萃取（E-120）效率最高，获得了最高的可溶性组分得率（61 g/100 g GP），该提取物具有高酚类含量（4.1 g GAE（没食子酸当量）/100 g提取物固形物）和强抗氧化能力（EC₅₀: 0.79 mg提取物/mg DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）），同时在325 mg/mL浓度下对无害李斯特菌（Listeria innocua）具有生长抑制作用。不溶性萃取残渣（38 g/100 g GP）亦保留了可观的酚类含量（10 g GAE/100 g），具有高抗氧化活性（EC₅₀: 1.5 mg残渣/mg DPPH）和富含纤维的组成，支持其作为功能性配料的价值。为改善操作性能和稳定性，E-120提取物被包埋于麦芽糊精或果胶中。对于两种聚合物，相对于提取物固形物40%的聚合物比例均可获得稳定的单相玻璃态粉末（T_g ~50 °C），热稳定性可延伸至200 °C。因此，SWE是一种从GP中获取功能性配料的高效可持续技术，可实现其高值化利用。

酿酒工业是全球最具生产力和盈利能力的农业部门之一。据国际葡萄与葡萄酒组织（International Organisation of Vine and Wine, OIV）统计，2024年全球葡萄酒产量达2.25亿百升，其中欧洲以1.48亿百升（约占总产量的66%）居主导地位。在整个生产链中，从葡萄种植到装瓶，酿酒行业产生大量副产物和残留物，约占加工葡萄量的30%。最常见的酿酒残留物包括葡萄茎、葡萄籽、酒糟和葡萄皮渣（GP），其数量因葡萄品种、成熟度、环境条件及具体酿酒工艺而异。GP是葡萄压榨步骤获得的副产物，占酿酒过程总废弃物的62%，主要由皮、籽、茎和果肉组成，占葡萄总投入量的15%–30%。GP的化学组成取决于葡萄品种、产地以及种植和加工条件。GP富含多酚类化合物，包括酚酸、黄酮类和花青素（红葡萄皮渣中），这些化合物具有抗氧化、抗菌、抗糖化以及对肿瘤细胞的细胞毒性等多种功效。因此，从GP中回收活性酚类富集提取物代表了该废弃物的高值化策略，在食品、制药和化妆品工业中具有广泛应用潜力。

亚临界水萃取（SWE）作为一种可持续高效的技术 alternative 应运而生，该技术通过将水加热至沸点以上同时施加足够压力以保持其液态，在100至374 °C和1至22.1 MPa条件下操作。在此条件下，水表现出降低的极性、黏度和表面张力，同时离子积常数增加，这些特性共同增强了质量传递、促进细胞壁破裂并使酚类等极性较低的化合物得以溶解。与传统有机溶剂萃取及微波、超声辅助技术相比，SWE可在避免有毒溶剂的同时获得更高的酚类含量和抗氧化能力，并最小化环境影响。先前研究表明，SWE过程可实现生物质的清晰分馏，半纤维素和其他聚合物部分水解并溶解于液相，而纤维素和木质素保留在固体残渣中，证实了其选择性和生物质高值化潜力。然而，尽管SWE回收GP中酚类化合物的潜力已得到证实，但可溶性提取物和不溶性残渣的集成利用相对而言关注较少，尽管其在最大化生物质高值化方面具有巨大潜力。

本研究旨在通过恒温和SWE对GP进行分馏，获得生物活性提取物和活性纤维富集不溶性组分，优化萃取温度以最大化酚类含量同时避免热降解。研究测试了120、140和160 °C三个萃取温度，并对提取物和固体残渣的质量得率、酚类含量、花青素含量和抗氧化活性进行了表征。在第二阶段，将酚类含量最高的提取物包埋于麦芽糊精或果胶基质中以获得更稳定的粉末配方，确保玻璃态、粉末流动性和增强的热稳定性。

研究样本来源于西班牙Requena地区（39.4896° N, 1.1003° W）2024年收获的Bobal品种红葡萄酿酒过程产生的红葡萄皮渣。SWE处理使用5 L容量压力反应器，三个萃取条件分别为120 °C/1.3 bar、140 °C/3.4 bar和160 °C/6.3 bar，均于150 rpm条件下进行30 min。处理后液相经真空过滤和冷冻干燥（?65 °C，0.8 mbar，72 h），不溶性残渣经蒸馏水洗涤后真空干燥（60 °C，48 h）。总酚含量采用Folin–Ciocalteu法测定，花青素含量采用Puissant-Léon法量化，抗氧化能力采用DPPH·自由基清除法评估，抗菌活性针对无害李斯特菌（Listeria innocua CECT 910）和大肠杆菌（Escherichia coli CECT 101）进行分析。最佳提取物采用麦芽糊精（12 DE）或果胶通过冷冻干燥进行包埋，聚合物与提取物固形物比例经优化范围为1%–60%（麦芽糊精）或1%–40%（果胶）。包埋产物通过傅里叶变换红外光谱（Fourier-Transformed Infrared Spectroscopy, FTIR）、热重分析（Thermogravimetric Analysis, TGA）和差示扫描量热法（Differential Scanning Calorimetry, DSC）进行表征。

**研究结果**

**GP的酚类和花青素含量**：采用水或甲醇-水（60:40，v/v）混合物在低温超声辅助条件下萃取GP酚类物质。结果表明，甲醇-水混合物的萃取效果优于纯水，30 min提取时间即可获得最优总酚和花青素含量，分别为7.9 g和0.042 g/100 g GP固形物。该提取物抗氧化活性最强（EC₅₀: 0.69 mg干燥提取物/mg DPPH），接近典型抗氧化剂如抗坏血酸（EC₅₀: 0.12 mg/mg DPPH）和α-生育酚（0.26 mg/mg DPPH）的水平。

**GP的SWE分馏**：不同温度下SWE处理GP的流程及产物特性研究表明，随着萃取温度升高，提取物和残渣呈现褐色加深现象，这可归因于非酶褐变反应如糖焦糖化和美拉德反应的加剧。质量得率结果显示，所有亚临界条件下均获得高萃取得率，GP固形物的55%–60%被溶解，但160 °C时得率较120 °C有所下降。残渣得率随温度升高而增加，所有条件下质量平衡接近98%，表明未发生显著挥发性化合物损失。SWE提取物和残渣的总酚含量（TPC）、花青素含量（AC）及抗氧化活性（EC₅₀）分析表明，提高SWE萃取温度并未增强酚类化合物萃取，反而降低了提取物和残渣的TPC，提示热诱导降解效应。120 °C时提取物酚类含量最高（4.1 g/100 g提取物固形物），按萃取得率计占GP总固形物的2.6%。提取物TPC与EC₅₀值的相关性较低（r = ?0.833），160 °C时EC₅₀值低于基于酚类含量的预期值，表明糖焦糖化或美拉德反应新生成的化合物也贡献了抗氧化能力。花青素的急剧减少证实了其对热的高度敏感性，其在SWE过程中的降解机制包括糖基化、水分子亲核攻击、分子结构裂解和聚合等。酚类和花青素在SWE过程中的分配显示，SWE残渣的TPC为3–4 g GAE/100 g GP，高于SWE提取物（1.2–2.6 g/100 g GP），表明酚类化合物在SWE过程中大量保留于固体基质中。两者含量之和接近生GP中的测定值，差异在±1 g GAE/100 g GP固形物范围内，可能源于Folin–Ciocalteu试剂反应性化合物的生成、部分酚类降解或植物基质结构变化促进后续萃取。

**SWE组分的生物活性**：SWE残渣甲醇-水提取物呈现极低的EC₅₀值，低于SWE提取物，表明保留于固体组分中的化合物具有高DPPH自由基清除能力。按GP固形物计，140和160 °C残渣的抗氧化能力与同温度SWE提取物相似，但低于120 °C SWE提取物。基于此，E-120被进一步评估抗菌活性。该提取物在测试最高浓度325 mg/mL下对无害李斯特菌和大肠杆菌未表现出杀菌活性，但对无害李斯特菌在325 mg/mL时观察到相对于初始计数2 log CFU的生长抑制，故该浓度可视为对无害李斯特菌的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC），而大肠杆菌生长不受该浓度范围提取物影响。这与Pedras等人观察到的GP提取物对革兰氏阳性菌更高抗菌效应的结果一致。E-120提取物在室温（约20 °C）呈橡胶态、黏滞状态，故采用高分子量载体（麦芽糊精和果胶）进行包埋以改善其操作性能和稳定性。

**SWE生物活性提取物的包埋**

**DSC分析**：不同比例麦芽糊精或果胶与E-120提取物冷冻干燥制备的固体基质经DSC分析确定获得高于室温T_g的玻璃态所需最低载体量。纯E-120粉末第一次加热呈现两个玻璃化转变温度（T_g1 = ?7.5 °C，T_g2 = 49 °C），表明冷冻过程中形成两相分离体系；第二次加热仅观察到单一T_g（43.6 °C），表明熔融混合发生。1%–30%麦芽糊精比例的粉末亦呈现两相分离，两相T_g随麦芽糊精比例增加而升高；40%比例时第一次加热出现单一T_g（51 °C），表明单一无定形相形成。超过40%后T_g变化不大，故40%麦芽糊精可实现提取物的有效包埋。第二次加热T_g升高（72 °C），反映初始分离组分的部分熔融混合、第一加热过程中低分子量化合物的可能降解或结合水的损失。果胶体系类似，1%–30%呈现两相分离，40%时出现单一T_g（约51 °C），证明该比例足以获得均质自由流动粉末。第二次加热T_g同样升高。

**热稳定性**：TGA和DTGA曲线分析表明，麦芽糊精起始降解温度（T_o）为276 °C，峰值降解温度（T_p）为315 °C；果胶T_o为176 °C，T_p为233 °C。E-120提取物从130 °C起呈现渐进失重，第一个热降解峰在147 °C（T_p），约15%质量损失，主要归因于游离糖降解；190–225 °C降解步骤（T_p = 204 °C）与半纤维素和果胶降解相关；后续步骤归因于木质素降解。低聚合物比例（1%–30%）时热行为与纯提取物相似，但147 °C峰减弱，显示聚合物的保护作用。麦芽糊精40%及以上时DTGA曲线与纯麦芽糊精降解模式相似，低分子量化合物降解峰显著最小化，表明麦芽糊精链与提取物组分间存在强分子相互作用，增加粉末内聚力和热稳定性。40%果胶同样赋予提取物低分子量化合物热稳定性，DTGA曲线变化与纯果胶相似，主峰移至231 °C。

**FTIR光谱**：E-120提取物FTIR光谱证实酚类化合物和聚合物的存在：3320 cm^?1处O–H伸缩振动（氢键）；2929和2860 cm^?1处C–H对称和不对称伸缩振动；1730 cm^?1处C=O伸缩振动（酚酸和糖醛酸的羧基和酯基）；1610、1535和1415 cm^?1处C=C伸缩振动（酚类芳香骨架）；1250、1150、1103、1021和925 cm^?1处C–O不对称和对称伸缩振动。包埋后光谱变化随聚合物比例增加而改变：1740 cm^?1峰（果胶酯基C=O）随果胶比例增加而增强；1535 cm^?1和1610 cm^?1处芳香环C=C伸缩振动峰相对强度随聚合物含量增加而降低，高比例时几乎不可检测。这些变化归因于酚类化合物芳香环与聚合物羟基之间可能形成的O–H···π相互作用，表明组分间的超分子耦合，解释了聚合物比例增加时低分子量化合物热稳定性的提高。

**讨论与结论**

研究人员通过恒定温度SWE对GP进行分馏，系统评估了温度对提取物和残渣组成及生物活性的影响。120 °C被确定为最优萃取温度，该条件下酚类化合物保留最完整，花青素降解最小化，同时获得高抗氧化活性提取物和富含纤维及酚类的功能性残渣。该温度策略平衡了萃取效率与热敏性化合物保护的需求。SWE技术的工业可扩展性和经济可行性基于水作为低成本无毒溶剂的使用，以及与连续或半连续流反应器的兼容性。然而，大规模实施仍需优化能源效率、材料耐腐蚀性和下游纯化成本。

包埋研究表明，40%聚合物比例是实现玻璃态转变和粉末流动性的关键阈值，低于此比例则因冷冻过程中相分离而无法形成均质无定形相。麦芽糊精和果胶均能有效稳定提取物，但作用机制可能因分子结构差异而异：麦芽糊精通过α-(1,4)糖苷键形成的空间网络提供稳定作用，果胶则通过半乳糖醛酸链的羧基和酯基与酚类形成特定相互作用。两种包埋体系均使热稳定性提升至约200 °C，满足食品加工中的热操作需求。

FTIR分析揭示的超分子O–H···π相互作用为理解聚合物-提取物相容性提供了分子层面解释，这种非共价相互作用阻止了低分子量活性物质的迁移和降解，是玻璃态稳定化的重要机制。T_g约50 °C的设计确保了室温贮存的物理稳定性，同时避免过高T_g导致的加工困难。

该研究的结论部分指出，120 °C和1.3 bar条件下的SWE是获得酚类富集可溶性提取物和纤维富集残渣的最有效条件。该温度更好地保留了花青素，主要在可溶性提取物中，同时两组分均显示更高抗氧化能力。可溶性组分占GP固形物的61%，酚类含量为4.1 g GAE/100 g提取物，DPPH自由基清除能力为0.79 mg/mg DPPH。不溶性萃取残渣（占GP固形物38%）同样富含纤维和酚类化合物（10 g GAE/100 g残渣），具有抗氧化能力（EC₅₀: 1.5 mg/mg DPPH）。两组分均可作为功能性配料用于食品工业，具体应用取决于最终用途。E-120提取物在麦芽糊精或果胶基质中于40%聚合物-提取物固形物比例下的包埋产生了稳定的均质玻璃态粉末，T_g约50 °C，热稳定性达约200 °C，确保了生物活性化合物的更好保存和粉末流动性。这些结果证明了SWE用于GP可持续高值化的可行性：获得酚类富集的水溶性提取物以及酚类和纤维富集粉末，可用作食品、制药和化妆品领域的配料。