亚历山大病大鼠模型中延髓感觉运动功能的行为学特征分析

《Behavioural Brain Research》：Behavioral characterization of bulbar sensorimotor function in a rat model of Alexander disease

　　

Jared Cullen|John Russell|Cynthia A. Kelm-Nelson|John Szot|Albee Messing|Tracy Hagemann|Nadine Connor

美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学麦迪逊分校耳鼻喉科-头颈外科

摘要

亚历山大病是一种由胶质纤维酸性蛋白基因突变引起的神经退行性疾病，会导致球部感觉运动功能障碍，包括吞咽困难、声音障碍和构音障碍。本研究对比了R237H大鼠模型与野生型对照组的口运动功能和喉功能。研究对大鼠的舌头力量和按压频率、咀嚼功能、吞咽功能以及超声发声行为进行了行为学评估。

与野生型对照组相比，R237H组大鼠的舌头力量和按压频率显著降低，且表现随时间逐渐恶化，表明其舌头力量较弱，难以持续发力。在咀嚼过程中，尽管咬合次数相似，但R237H组大鼠需要更长的咀嚼时间和更多次咀嚼动作，反映出口腔处理效率低下。视频荧光镜吞咽研究显示，R237H组大鼠的口腔相持续时间更长，吞咽开始前的下颌活动周期也更多，这说明其在吞咽过程中的口运动协调能力存在缺陷，而食团大小、下颌活动频率及食团移动速度则保持正常。超声发声分析显示，R237H组大鼠最长的发声持续时间也较短，表明其发声功能受损。

综上所述，这些研究结果表明R237H大鼠模型在舌头功能、咀嚼功能、吞咽功能及发声功能方面均存在明显缺陷。这些行为学异常与亚历山大病患者所表现出的球部症状一致，进一步丰富了对该模型的认知。本研究为未来探讨该模型中球部功能障碍的机制及转化应用奠定了行为学基础。

引言

亚历山大病是一种由胶质纤维酸性蛋白基因突变引起的神经退行性疾病，该蛋白是一种中间丝蛋白，主要在中枢神经系统的星形胶质细胞中表达[1]、[2]、[3]。这是一种罕见、严重且通常致命的疾病，发病年龄不一，可从胎儿期到成年晚期不等。虽然该病为单基因疾病，但其临床表现极为多样，包括脑干介导的运动功能障碍，会影响言语、吞咽及口运动协调能力[4]。目前有多种分类系统用于描述这种临床异质性，但所有系统都认为大部分患者存在脑干功能受损的情况，从而导致吞咽困难和声音障碍[4]、[5]、[6]。这些症状会严重影响患者的生活质量，还会导致沟通障碍、营养不良、代谢紊乱以及生长发育不良[7]、[8]，同时还会增加阻塞性睡眠呼吸暂停和吸入性肺炎的风险[4]、[6]、[7]、[9]。目前针对亚历山大病中脑干介导的功能障碍的机制研究还十分有限。

由于缺乏合适的亚历山大病动物模型，相关研究在理解该病的口运动功能障碍机制方面进展缓慢。尽管现有的小鼠模型，包括转基因小鼠和敲入小鼠，能够模拟亚历山大病的关键分子和细胞特征，但这些模型以及以往的所有亚历山大病动物模型都未曾对口运动功能进行过评估[10]、[11]、[12]、[13]。为了研究亚历山大病，人们还开发了斑马鱼和果蝇等非哺乳动物模型，但这些模型的表型与哺乳动物模型差异较大，其口运动生理机制也有所不同，因此不太适合用于研究口运动功能障碍[14]、[15]、[16]。至今，尚未有任何亚历山大病动物模型被用于评估口运动功能，这限制了人们对该疾病在舌头功能、咀嚼功能、吞咽功能及发声功能方面影响的了解。

为解决这些难题，研究人员此前开发了一种杂合Gfap^+/R237H大鼠模型，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，将与人类严重的R239H变异株同源的R237H突变引入大鼠的内源Gfap基因位点[17]。该R237H模型表现出与亚历山大病相关的中枢神经系统异常，包括多个脑区（包括脑干）的GFAP蛋白积累增多、罗森塔尔纤维形成和星形胶质细胞增生、白质功能受损、颈椎脊髓体积缩小，以及通过开放场地试验、握力测试、旋转棒测试和水平梯子测试所观察到的运动功能障碍[17]。最近的研究还发现，该模型脑干尾部存在大量GFAP蛋白积累和星形胶质细胞病变，同时脑干和脑脊液中的GDF15水平也升高[8]。这些研究都表明R237H大鼠模型存在中枢神经系统及脑干的异常。这些发现与人类患者的症状有一定关联，因为亚历山大病患者常常会出现体重下降或生长迟缓、进食困难以及其他提示球部功能障碍的症状[5]、[6]。本研究旨在补充之前的研究，探讨R237H模型是否也存在与亚历山大病患者的吞咽和沟通相关的球部感觉运动功能障碍。

之所以选择研究舌头功能，是因为舌头在食物获取与处理、食物通过口腔的过程、气道保护以及与言语相关的运动行为中起着核心作用[18]。亚历山大病患者常常出现吞咽困难，这可能与食物通过口腔的时间过长、咽部残留物增多以及吸入风险升高有关，这类情况与其他神经退行性疾病中的表现类似，都是因为舌头力量不足和协调能力下降导致吞咽效率降低[19]。舌头耐力和疲劳度下降也与吞咽功能障碍有关[20]。在衰老、中风和神经退行性疾病中，当舌头功能受损时，言语和吞咽的效率会显著下降[21]。由于舌头也是康复治疗的主要目标，因此对舌头功能进行定量评估有助于了解具有临床意义的球部功能障碍[22]。

同样，喉部对于声音产生和气道保护也至关重要，喉返肌在发声过程中对声带闭合起着关键作用[23]、[24]、[25]。啮齿类动物产生的高频声音——超声发声，是评估发声特征的有效工具，因为这些声音会受到喉部和呼吸系统的影响[26]。在交配期间，雄性大鼠会发出频率、持续时间和声学特征各不相同的超声发声。运动控制障碍或肌肉病变可能会改变超声发声的声学参数，从而帮助了解与疾病相关的发声功能障碍[21]、[27]、[28]、[29]。这类障碍可能还伴随着周围肌肉病变和基因表达异常，因此超声发声可作为识别早期神经退行性变化的敏感行为指标，为研究疾病相关的发声功能障碍和沟通障碍提供依据[30]。

在本研究中，我们采用了之前用于研究衰老大鼠模型[21]、[31]、[32]、帕金森病模型[25]、[28]、[31]、阿尔茨海默病模型[30]以及中风模型[33]的经过验证的行为评估方法。我们的目标是确定R237H大鼠模型是否也存在与人类患者类似的口运动功能障碍[7]。具体而言，我们比较了R237H组大鼠与年龄匹配的野生型对照组大鼠在舌头力量、咀嚼功能、吞咽功能及发声功能方面的差异。基于之前关于运动功能和脑干受累的研究结果[11]、[34]，我们推测R237H组大鼠的球部运动功能会显著低于野生型对照组大鼠。

章节节选

材料与方法

本研究遵循美国公共卫生服务局在《NIH实验室动物护理和使用指南》第8版（2011年）中规定的实验室动物护理和使用标准。所有实验方案均得到了研究机构动物护理和使用委员会的批准。

舌头力量和按压频率

R237H组大鼠的最大自主舌头力量显著低于野生型对照组大鼠（图2A，均值差为55.37毫牛顿，95%置信区间为35.85–74.89毫牛顿，t值为6.083，p值小于0.0001，Cohen’s d值为2.80）。同样，R237H组大鼠每次按压的舌头力量均值也显著降低（图2B，均值差为13.45毫牛顿，95%置信区间为8.19–18.71毫牛顿，t值为5.573，p值小于0.0001，d值为2.56），说明这两项指标的效应量都很大。以下为典型的舌头按压力量曲线图

讨论

本研究的目的是通过量化评估舌头力量、咀嚼功能、吞咽功能以及超声发声行为，来研究R237H大鼠模型中的球部运动功能。亚历山大病的特征是GFAP蛋白异常积累以及星形胶质细胞病变，包括星形胶质细胞的细突丢失和信号传导异常，这些变化会破坏星形胶质细胞与神经元的相互作用，进而影响神经回路的功能[3]、[34]。由于星形胶质细胞是重要的神经调节细胞

结论

本研究首次对R237H大鼠模型中的口运动功能障碍进行了行为学分析。在舌头功能、咀嚼功能、吞咽功能及发声功能各项检测中，R237H组大鼠均表现出与亚历山大病临床特征相符的球部运动功能障碍。这些发现进一步丰富了对该模型的认知，证明了该模型在研究亚历山大病球部功能障碍方面的应用价值。同时也凸显了这项研究的新颖性和重要性

资助/项目编号

本研究得到了以下项目的资助：R01DC018071、R01AG085564、T32DC009401、R37CA225608、R01NS117469、P01HD076892

作者贡献说明

Tracy Hagemann：文章撰写——审阅与编辑、资源协调、概念设计。Nadine Connor：文章撰写——审阅与编辑、研究监督、资源协调、项目管理、方法设计、资金筹集、概念设计。John Szot：软件使用、实验开展、数据整理。Albee Messing：文章撰写——审阅与编辑、资源协调、资金筹集、概念设计。Cullen Jared Steven：文章撰写——初稿撰写、数据可视化、结果验证、实验开展、正式数据分析、数据整理。John Russell：