一种基于电化学阻抗谱技术的新型生物传感器的开发，用于检测体液中的骨形成与吸收生物标志物

《Bioelectrochemistry》：Development of a novel electrochemical impedance spectroscopy-based biosensor for bone formation-resorption biomarker determination in body fluids

　　

Rabia Semsi|Günay Afandiyeva|Erdal Ergunol|Aylin Sepici Dincel

土耳其安卡拉加齐大学健康科学研究所医学生物化学系

摘要

背景

本研究旨在开发一种灵敏、选择性高且成本低的电化学阻抗生物传感器，用于单独检测两种关键的骨代谢标志物：I型原胶原N端前肽（PINP）和β-C端肽（β-CTX）。

材料与方法

金电极经3-巯基丙酸修饰形成自组装单层结构。通过EDC/NHS化学方法将针对PINP和β-CTX的单克隆抗体共价固定在电极上。每一步固定过程都通过电化学阻抗谱和循环伏安法进行表征。该生物传感器在人工血清、唾液和尿液中的性能进行了评估，并与ELISA和ECLIA参考方法进行了比较。

结果

在优化条件下，β-CTX生物传感器的线性检测范围为10–60?pg?mL^?1（检测限为2.9?pg?mL^?1），而PINP生物传感器的检测范围为10–60?ng?mL^?1（检测限为3.4?ng?mL^?1）。样品回收率在84%到105.6%之间。该生物传感器与ELISA和ECLIA方法的检测结果相关性很强（r值≥0.9977，p值＜0.0001）。其存储稳定性约为8–10周。

结论

所开发的生物传感器系统能够检测血清以及唾液、尿液等非侵入性体液中的PINP和β-CTX，为监测代谢性骨疾病提供了一种低成本、快速的替代传统方法的方式。

引言

骨组织处于一个动态的重建周期中，包括由成骨细胞负责的骨形成和由破骨细胞负责的骨吸收。这种生理平衡被打破后，就容易引发骨质疏松症、类风湿性关节炎、佩吉特病以及转移性骨疾病等病症。据估计，全球范围内三分之一的绝经后女性和五分之一的50岁以上男性有发生骨质疏松性骨折的风险，因此，早期且准确地监测骨代谢已成为全球公共卫生领域的重点任务[1]、[2]。

目前，双能X射线吸收测定法被认为是测量骨密度最常用的方法。不过，DEXA也存在诸多局限性，比如无法及早检测骨微结构中的动态生化变化，无法完全反映个体的骨折风险，而且需要至少2–3年的随访才能评估治疗效果[3]、[4]。

正因如此，骨代谢标志物在临床上的重要性日益凸显，因为它们能够实时反映骨代谢的动态变化，相比影像学方法能更早地显示出治疗反应。国际临床化学与实验室医学联合会以及国际骨质疏松基金会建议将I型原胶原N端前肽和β-C端肽作为诊断及监测骨质疏松症及相关骨疾病的参考指标[5]、[6]。

PINP是一种在I型胶原蛋白合成过程中被切割产生的前肽，I型胶原蛋白是骨基质中的主要结构蛋白，因此PINP可直接反映成骨细胞的活性。β-CTX则是破骨细胞分解I型胶原蛋白时释放到血液中的肽段，可反映骨吸收情况。临床上通常通过ELISA和电化学发光免疫分析法来检测这两种标志物，但这些方法存在设备昂贵、孵育时间长、依赖中心实验室以及需要专业技术人员等不足之处[7]、[8]。

电化学生物传感器作为一种极具潜力的分析工具，有望克服这些缺陷，它具有高特异性和灵敏度、便于携带、成本低、所需样本量少以及能实时出结果等优点[9]、[10]。基于自组装单层结构和电化学阻抗谱的技术，可以通过在电极表面稳定且有序地固定生物分子，实现高灵敏度的蛋白质检测[11]、[12]。

现有文献表明，针对骨生物标志物的生物传感器研究还相对较少。Inal Kabala等人（2019年）开发了一种基于EIS的免疫传感器用于检测骨钙素[13]；Khashayar等人（2024年）则报道了一种可用于同时检测血清中β-CTX和PINP的多功能生物传感器系统[14]。然而，目前仍缺乏在血清以外的非侵入性体液中检测这两种标志物的方法，也缺少在这些体液环境中进行的全面方法对比研究。本研究正是针对这一需求，开发了用于血清、唾液和尿液中检测PINP和β-CTX的独立EIS基免疫传感器，并对其进行了分析表征，同时与ELISA和ECLIA参考方法进行了比较。

章节节选

所用设备与化学物质

电化学测量是在标准的三电极电池结构中进行的，工作电极为直径6毫米（表面积0.28平方厘米）、来自美国的Basi MF-2014型金电极；参比电极为含有饱和KCl溶液的Ag/AgCl电极，同样来自美国，型号为Basi MF-2021；辅助电极为美国Basi公司生产的铂丝，型号为MF-1032。测量工作是用荷兰Palm Sens公司的Palm Sens EmStat3恒电位仪/恒电流仪配合PSTrace软件完成的。

3.1.1. 扫描电子显微镜分析

未经处理的金电极的扫描电子显微镜图像显示，其表面均匀且干净，具有多晶结构典型的微粗糙边缘。经过3-巯基丙酸形成自组装单层结构后，电极表面的形态变得更加规则。经过EDC/NHS活化处理后，可以看到针状晶体结构，这是由于溶剂蒸发后EDC/NHS试剂沉淀所形成的。在抗体被固定到电极表面后，电极表面上出现了许多颗粒状结构，表面密度也有所增加。

讨论

本研究开发的基于EIS的电化学生物传感器系统，能够灵敏、选择性地检测血清、唾液和尿液中的PINP和β-CTX这两种骨代谢标志物，且检测结果具有较好的重复性。各项分析性能参数以及与参考方法的比较结果都表明，该生物传感器具备临床应用价值。

在电极表面修饰方面，选择3-巯基丙酸作为形成自组装单层结构的物质。3-巯基丙酸中的巯基可以形成稳定的单层结构。

结论

本研究成功开发了基于3-巯基丙酸自组装单层策略的独立EIS基免疫传感器，可用于检测血清、唾液和尿液中的PINP和β-CTX这两种骨代谢标志物，同时也对这些传感器进行了验证。该系统的优点如下：

（1）灵敏度很高，β-CTX的线性检测范围为10–60?pg?mL^?1（检测限为2.9?pg?mL^?1），PINP的检测范围为10–60?ng?mL^?1（检测限为3.4?ng?mL^?1）；

（2）准确性和重复性优异，在各种检测体系中，样品回收率都在84%到105.6%之间，变异系数则在2.1%到7.4%之间；

CRediT作者贡献说明

Rabia Semsi：文章撰写——审阅与编辑、文章撰写——初稿撰写、资源获取、方法设计、正式分析、数据整理、概念构思。Günay Afandiyeva：正式分析、数据整理。Erdal Ergunol：资源获取、资金筹集、概念构思。Aylin Sepici Dincel：结果可视化、方法验证、项目监督、资源协调、项目管理、实验开展、资金筹集、概念构思。

利益冲突声明

作者声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：Rabia Semsi表示曾获得加齐大学的资金支持，此外她与加齐大学还存在包括资金资助在内的其他关联关系。Rabia Semsi还拥有一项编号为PCT/TR2025/051762的专利，正在向国际机构申请注册。作者声明不存在任何可能影响研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了加齐大学科学研究项目（BAP）的支持，项目编号为TDK-2024-9725，项目名称为“用于检测体液中骨形成与骨吸收标志物的生物传感器的研发”。图表摘要是通过BioRender软件于2025年制作的。