RLY-2608与STX-478特异性抑制致癌性PI3Kα突变的分子结构基础

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Molecular architecture responsible for specific inhibition of oncogenic PI3Kα mutants by RLY-2608 and STX-478

　　

磷脂酰肌醇3-激酶α（PI3Kα）的热点突变，如H1047R、E542K和E545K，可驱动多种癌症类型的肿瘤发生。靶向PI3Kα的变构抑制剂（Allosteric Inhibitor）RLY-2608和STX-478为突变体特异性抑制提供了有前景的途径。本研究报道了RLY-2608和STX-478结合的H1047R、E542K及E545K突变体的高分辨率冷冻电子显微镜（Cryo-EM）结构，揭示了仅在致癌突变体中通过激活环（Activation Loop）大幅构象重排才能进入的共享隐蔽变构口袋（Cryptic Allosteric Pocket）。尽管两种抑制剂均占据此口袋，但其具有不同的相互作用网络并传递 divergent 的变构活性：RLY-2608诱导催化元件和膜相互作用元件的大规模重塑，而STX-478则增强p110α与p85α亚基间的自抑制界面。比较分析为两者差异化的效价和选择性提供了结构性见解。

PI3Kα作为脂激酶家族成员，通过磷酸化质膜上磷脂酰肌醇的3'-羟基基团调控细胞代谢、存活及运动等关键过程，其功能失调与肿瘤、炎症及代谢性疾病密切相关。在PI3K家族中，由催化亚基p110α与调节亚基p85α组成的I A类异源二聚体PI3Kα因其在肿瘤发生中的核心作用而备受关注。约80%的功能获得性p110α突变集中于三大热点区域：激酶结构域的H1047R以及螺旋结构域的E542K/E545K。其中H1047R突变增强膜结合与催化活性，而E542K/E545K则破坏与p85α的抑制性相互作用，两者均导致PI3K/AKT通路持续活化。

现有的大多数PI3K小分子抑制剂为正构抑制剂（Orthosteric Inhibitor），通过与ATP竞争结合激酶活性位点来发挥作用，如已获批的阿培利司（Alpelisib，BYL-719）。然而，这类药物受限于p110α活性位点的突变景观约束、继发性耐药突变倾向以及对野生型（WT）PI3Kα的剂量限制性靶点毒性，导致治疗窗口狭窄并引发高血糖等不良反应。为此，研究人员致力于开发变构抑制剂。RLY-2608和STX-478是两类新型变构抑制剂，对H1047R相对于WT分别表现出12倍和14倍的选择性偏好，但其选择性结构基础尚不明确。

研究人员团队解析了RLY-2608和STX-478分别与三种致癌突变体（H1047R、E542K、E545K）结合的高分辨率冷冻电镜结构，并通过实验验证阐明了两种抑制剂的独特结合模式、变构调控机制及分子架构，为下一代治疗药物的开发提供了结构性框架和机制性见解。该研究成果发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》。

本研究采用的关键技术方法包括：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备PI3Kα异源二聚体蛋白（p110α/p85α），经化合物孵育后通过冷冻电镜技术（Cryo-EM）在Titan Krios电镜上进行数据采集；运用CryoSPARC进行图像处理、三维重构及局部分辨率优化；采用分子动力学（MD）模拟软件Gromacs 2021.4进行动态行为分析，通过CHARMM36m力场和TIP3P水模型进行系统模拟；结合Western blot、CCK-8细胞活力检测及HTRF脂质激酶活性测定进行功能验证；使用COOT和PHENIX进行结构精修与模型构建。

结构与功能分析揭示了RLY-2608和STX-478的结合特性及变构抑制机制。

RLY-2608在变构口袋中的结合特征：RLY-2608占据由催化环（残基909–920）、激活环（残基933–958）、kα9（残基996–1009）和kα10（残基1016–1025）形成的非典型浅口袋，该位点区别于正构抑制剂常用的ATP结合位点。此隐蔽口袋在apo态及抑制剂结合的野生型PI3Kα中被完全遮蔽，而RLY-2608结合诱导激活环N端区段 outward 位移7.6 ?（F937的Cα原子），从而扩张变构口袋使抑制剂深插其中。RLY-2608以氨基异吲哚酮为核心，其2-氯-5-氟苯基深入kα9与kα10之间的裂隙，通过π-堆积与F1002作用，并与E1012的羰基及K942的侧链氮形成卤键；3-氟-5-三氟甲基苯环被激活环N端和kα10 clasped；中央氨基异吲哚?酮核心处于K942与Y1021之间，参与阳离子-π和π-π相互作用。功能验证表明，K942、E1012和F1002等关键口袋残基的丙氨酸取代削弱了RLY-2608抑制pAKT（S473）的能力，体外激酶实验证实K942E或E1012A显著减弱其抑制活性（H1047R单突变IC₅₀为12.0 nmol/L）。

RLY-2608的突变体特异性抑制：虽然RLY-2608与BYL-719结合的H1047R整体结构相似（Cα RMSD 0.82 ?），但变构位点、激活环、磷酸结合环（P-loop，残基771–777）及膜结合环等关键区域发生显著局部重排。具体而言，激活环C端区段（943–949）变得无序，相邻区域952–955发生构象位移；催化性DRH基序（残基915–917）中R916产生5.8 ?的Cα位移；P-loop远离催化位点，A775位移4.1 ?；三个膜结合环均发生调整，其中膜结合环1的D725位移1.9 ?，环2的F872位移3.0 ?，环3的T972位移2.8 ?。同时，RLY-2608结合增强了p110α的ABD与p85α的相互作用以及p85α nSH2与p110α的接触，但削弱了iSH2与p110α的相互作用，从而稳定自抑制态。E545K和E542K中这些构象变化得以保留（与各自BYL-719结合结构相比，RMSD分别为1.0 ?和1.2 ?），表明RLY-2608通过稳定隐蔽口袋并传播结构性变化以扰动催化核心和增强p85α对p110α的自抑制，实现共同抑制机制。

比较RLY-2608结合的三类突变体结构，整体架构高度保守（H1047R与E545K RMSD 0.6 ?，H1047R与E542K RMSD 0.8 ?），但激活环存在突变特异性差异：F937在E545K中位移1.1 ?；D939在不同突变体中采取不同构象旋转异构体；P-loop中A775取向差异显著（Cα距离4.5 ?）。分子动力学模拟显示，RLY-2608结合的WT系统占据狭窄的、低溶剂可及表面积（SASA）的构象盆地，而三种致癌突变体采样更广泛且异质的构象分布，但总体与冷冻电镜参考结构一致。

STX-478在变构口袋中的结合特征：STX-478与RLY-2608共享高度一致的隐蔽变构口袋（5 ?半径内14个共同激酶残基），但其线性分子拓扑（以脲连接子为中心，缺乏3-氟-5-三氟甲基苯基团）导致不同的相互作用谱。末端嘧啶环被激活环与催化环包围，其胺基与D915和E950侧链形成两个氢键；中央脲连接子作为关键桥梁，填充两环间隙并与G912的骨架原子及F937、D939、H940的激活环残基形成极性网络；三氟甲基基团伸向kα10与Y1021形成范德华接触；苯并呋喃部分深入由kα9、kα10和催化环构成的疏水裂隙，通过π-堆积与F937和F1002作用，并与L938、I1019和I1022产生疏水接触。关键残基K942、H940和F1002的单点突变减弱了STX-478介导的pAKT抑制，体外激酶实验证实K942E和H940F完全 abolish 其剂量依赖性抑制（H1047R单突变IC₅₀为2.2 nmol/L）。

STX-478结合姿态在冷冻电镜结构中相对于其与inavolisib共晶结构（PDB ID: 8TGD）向外偏移，苯并呋喃部分从X射线结构中的kα2/kα9亚口袋 withdrew 向kα9/kα10方向（氟原子与Q809 Cα的最小距离从3.6 ?增至9.3 ?）。与H1047R相比，STX-478在E542K和E545K中的结合存在差异：D915侧链向外旋转消除了与嘧啶环胺基的盐桥相互作用，激活环的高构象灵活性 destabilized STX-478结合，E545K中嘧啶胺仅与R951和催化环骨架形成较弱的替代相互作用。

STX-478的突变体特异性抑制：STX-478结合的H1047R与BYL-719结合结构相比整体相似（Cα RMSD 1.3 ?），但激活环、P-loop、p110α膜结合环及p85α特别是iSH2结构域发生局部重排。激活环N端（933–945）从螺旋展开为延伸环构象，D939和K944分别位移5.3 ?和8.2 ?；与RLY-2608不同，STX-478保持DRH基序的规范构象。STX-478结合诱导kα8、kα11、P-loop和膜结合环的协同位移；p110α-p85α界面发生显著构象变化，E601与K941/K942形成盐桥，E520 Cα位移5.0 ?并破坏与R514的原有盐桥而形成与K513的新盐桥，增强自抑制界面。E545K和E542K中STX-478结合的结构与BYL-719结合形式全局相似（RMSD分别为1.7 ?和1.3 ?），但iSH2-ABD界面连续性电子密度改善，提示STX-478有助于稳定该界面。E545K中激活环D939产生6.2 ?的Cα位移，P-loop和膜结合环重新定位；E542K中kα2、kα8、kα9和kα11螺旋发生重排。

比较STX-478结合的三类突变体，H1047R与E545K/E542K之间存在关键差异：H1047R中D915与K941之间的独特盐桥稳定STX-478结合，而E545K中激活环H936向外旋转2.5 ?，V952产生4.6 ?的Cα位移，结构无序增强；E545K中P-loop的S773位移3.0 ?，RBD发生显著重排（相对于H1047R的Cα RMSD 2.5 ?）。分子动力学模拟显示，STX-478在WT、E542K和E545K中保持稳定结合，但H1047R表现出更显著的动态变异，催化环灵活性增加（SASA约540 ?² vs WT约390 ?²），而激活环相对受约束，这种trade-off可能解释STX-478在H1047R中实现最强效的悖论性观察。

讨论部分总结：本研究揭示了两种首创性变构PI3Kα抑制剂的高分辨率冷冻电镜结构，发现共享的隐蔽变构口袋通过激活环N端区段的显著外排挤入形成。RLY-2608和STX-478虽占据相同口袋，但采用不同机制抑制PI3Kα活性：RLY-2608诱导激活环大规模构象重排，耦合P-loop、催化性DRH基序和膜结合环的实质性重塑；STX-478则主要通过增强p110α与p85α之间的自抑制界面发挥抑制作用。两种抑制剂均调控激活环、P-loop、p85α的iSH2和nSH2结构域等关键调控界面，协同性构象变化不仅破坏催化能力，还改变膜接近性和取向，将变构抑制与膜相关信号联系起来。

突变特异性构象可塑性决定配体选择性。尽管E545K和E542K存在特异的构象景观（如iSH2-nSH2相互作用模糊），两种抑制剂仍能在其他功能结构域诱导结构扰动。RLY-2608的刚性三维支架容忍激活环增强的移动性和重排的调控表面，保持对H1047R和E545K（>12倍vs WT）、E542K（>8倍vs WT）的效价；STX-478的线性/延伸拓扑对激活环相关区域的构象变异性更敏感，可能限制其对H1047R（>14倍vs WT）的强效抑制，而对WT、E542K和E545K产生相似效价。PIK3CA的继发性耐药突变改变正构抑制剂结合口袋，而变构口袋在这些耐药突变背景下仍保持可及性，为克服耐药提供机制基础。激活环和催化环作为核心变构传递装置，其突变体和抑制剂特异性的构象状态可作为药物发现的分子指纹。

研究结论：本研究为PI3Kα热点突变的变构抑制机制提供了详细的结构见解。这些发现不仅推进了对PI3Kα变构调控的理解，也为靶向这些致癌突变体奠定了基础。