基于适配体-血红素/G-四链体识别和超分支滚环扩增的肌酸激酶同工酶MB检测方法研究

《ACS Measurement Science Au》：A Hyperbranched Rolling Circle Amplification Assay Using Aptamer–Hemin/G-Quadruplex Recognition for the Detection of Creatine Kinase-MB

　　

肌酸激酶-心肌带（CK-MB）仍然是急性心肌梗死早期诊断和临床管理的重要生物标志物。研究人员报道了一种基于构象锁定适配体G-四链体（G-quadruplex）系统结合磁纳米颗粒捕获和超分支滚环扩增（HRCA）的灵敏比色检测方法。靶标结合诱导适配体构象解锁，启动HRCA介导的信号扩增，并在显色底物存在下产生浓度依赖性的比色响应。研究人员采用紧凑型三维打印成像模块结合基于Python的处理流程，从检测图像中提取灰度强度值进行定量分析。该检测方法仅需25 μL样品，在水相样品中检出限（LOD）为0.268 ng/mL，在加血样品中为0.328 ng/mL；定量限（LOQ）分别为0.89 ng/mL和1.09 ng/mL，线性动态范围为0.5–100 ng/mL。灰度强度与CK-MB浓度呈负相关，可在临床相关水平范围内实现定量检测。研究人员进一步通过TapeStation凝胶电泳验证了HRCA扩增过程和靶标诱导激活机制，确认了扩增DNA纳米结构的形成。该平台为CK-MB检测提供了一种低体积、基于扩增的策略，兼容简易光学读数，在即时检测（POC）应用中具有良好潜力。

该研究发表于《ACS Measurement Science Au》。研究背景方面，急性心肌梗死（AMI）是紧急就诊和死亡的主要原因之一，据美国心脏协会（AHA）2025年更新数据，美国每年约有805,000例心肌梗死发生。AMI的初始评估依赖心电图（ECG），其对ST段抬高型心肌梗死（STEMI）高度有效，但对于非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）敏感性显著降低，因此生化心脏标志物与ECG联合使用成为确诊AMI的标准手段。目前，心肌肌钙蛋白（cTnI和cTnT）是诊断AMI的金标准，但其浓度通常在症状发作后16–30小时才达峰值，限制了其在早期检测中的应用。肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）作为心肌富集型同工酶，在症状发作后3–6小时即可检出，12–24小时达峰，2–3天恢复基线，在识别急性心肌损伤和区分近期与既往梗死方面具有重要临床价值。人血清中CK-MB浓度低于约7 ng/mL视为正常，升高则提示心肌损伤。现有实验室检测方法如Roche Cobas e411虽具有高灵敏度，但需处理血清或血浆、专业人员操作、周转时间1–3小时，且依赖温度敏感试剂和大型仪器（>100 kg），限制了其在急诊场景中的应用。因此，开发适用于POC的CK-MB检测策略具有重要意义。

适配体（Aptamer）作为通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选获得的短单链DNA或RNA寡核苷酸，具有化学稳定性高、合成可重复性好、易于修饰等优势，已成为抗体的重要替代识别元件。构象锁定适配体设计基于分子信标结构，适配体最初与短互补封闭链杂交以稳定非活性构象，抑制非特异性靶标相互作用；靶标结合后适配体发生构象重排，置换封闭链从而激活靶标识别。然而，该机制产生的信号变化常不足以灵敏检测CK-MB等低丰度生物标志物。因此，研究人员将适配体与等温核酸扩增技术（iNAATs）结合以提高检测灵敏度。滚环扩增（RCA）作为一种突出的iNAAT，具有等温操作、扩增效率高、POC兼容性好等优势。

研究人员主要采用以下关键技术方法：磁纳米颗粒（MNP）用于靶标捕获和全血分离；构象锁定适配体设计包含内部夹板序列，靶标结合后暴露该序列以启动扩增；超分支滚环扩增（HRCA）通过两阶段扩增产生富含鸟嘌呤的DNA产物并形成G-四链体结构；G-四链体与血红素（hemin）结合形成过氧化物酶模拟物催化ABTS显色反应；三维打印便携式成像模块结合基于Python的图像处理流程提取RGB并转换为灰度值进行定量；TapeStation凝胶电泳验证扩增产物。

研究结果部分：

理论验证传感机制：研究人员使用NUPACK软件包模拟工程化适配体的折叠行为。无靶标时，适配体-夹板复合物保持闭合构象，poly-A（A8）间隔区减少空间位阻并实现高效的构象切换。夹板序列经BLAST验证与人基因组序列无匹配以避免交叉扩增。NUPACK模拟显示适配体与环形锁探针及引物混合物的预测最小自由能为-43.89 kcal/mol，表明强热力学稳定性。碱基配对概率图证实茎环区域的高稳定性，平衡浓度模拟显示完整三链HRCA启动复合物的平衡浓度超过300 nM，而非特异性相互作用极少。

HRCA扩增子形成的验证：研究人员通过凝胶电泳验证HRCA产物。锁探针与互补夹板寡核苷酸杂交后经T4 DNA连接酶连接形成环状DNA，再用核酸外切酶III处理去除线性DNA以确保特异性。TapeStation电泳显示，100 nM夹板存在时约300 bp处出现特征条带，证实环化成功；无夹板对照仅见约50 bp线性锁探针条带。HRCA阳性样品显示高分子量条带，电泳图谱揭示主要峰位于59,108 bp，而无CK-MB的阴性对照无扩增峰。5 ng/mL CK-MB即可诱导构象开关并启动HRCA，产生约15,000 bp条带。UV-vis光度法定量证实适配体成功偶联至MNP（初始260 ng/μL，偶联后上清降至75 ng/μL）；HRCA引物可显著增强扩增效率。

检测灵敏度测定：研究人员评估了HRCA产生的血红素-G-四链体的过氧化物酶样活性。ABTS/H₂O₂体系中，G-四链体催化ABTS氧化产生绿色信号。自主开发的比色读数器采用三维打印不透光丙烯酸支架、LED背光面板、N52磁铁磁分离环及手动对焦网络摄像头，配合Python程序实时提取RGB值并转换为灰度值。水相样品中，CK-MB浓度0.5–100 ng/mL范围内，灰度强度与浓度呈负相关，240 s后出现明显信号变化；Δ灰度值随CK-MB浓度增加而降低，Student's t-test显示各浓度与对照组差异显著（p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001）。校准曲线线性关系良好（R² = 0.977），LOD为0.268 ng/mL，LOQ为0.89 ng/mL。研究人员优化了HRCA反应时间和锁探针浓度：固定10 nM锁探针时，45 min至4 h信号递增；为缩短检测时间，提高锁探针浓度至500 nM可将反应时间缩短至45 min且获得等效信号（灰度值70），UV-vis吸收值达0.77，各浓度间差异显著（P < 0.05至P < 0.001）。

血液样品分析：加血样品中CK-MB浓度0.5–100 ng/mL范围内同样呈现灰度值与浓度的负相关，Δ灰度值随浓度增加而降低（p < 0.01, p < 0.001）。校准曲线R²为0.895，LOD和LOQ分别为0.328 ng/mL和1.09 ng/mL。22份加血样品的回收率为100%–114%，相对标准偏差（RSD）为3.93%（n=3），表明良好精密度。特异性实验显示，肌红蛋白、cTnI和cTnT的Δ灰度值极低（约20），而CK-MB差异显著（约81，P < 0.001），证实检测的高特异性。

讨论与结论部分：研究人员总结建立了整合夹板辅助锁探针连接、HRCA和便携式比色读数器的快速集成工作流程。通过优化25°C、100 nM夹板浓度的连接条件提高环化效率。该检测方法在适当保存条件下（-20°C和4°C）关键组分可稳定保存一个月。与现有方法相比，该策略虽检测限在ng/mL范围，但与CK-MB临床相关浓度范围匹配；荧光或纳米材料辅助方法虽可达pg/mL级别，但涉及复杂仪器和多组分系统限制了实用性。与西门子、罗氏、雅培等商业平台（采用电化学发光、电化学检测、荧光免疫测定等技术）相比，本研究开发的HRCA比色检测LOD为0.328 ng/mL且无需额外仪器，可见读数产生时间小于2分钟，总检测时间45分钟。该平台具有核酸可编程性、便携性、全血兼容性和最小基础设施需求，可通过空间分离检测区域或采用不同显色底物系统扩展至cTnI、cTnT和肌红蛋白等多重心肌标志物检测。虽然该检测已在加血样品中验证，但尚需临床患者样品进一步验证以确立临床应用价值。

研究结论翻译："总之，我们建立并验证了一种快速的CK-MB检测集成工作流程，结合了夹板辅助锁探针连接、超分支滚环扩增和便携式比色读数器。通过优化25°C下100 nM夹板浓度的连接条件提高了环化效率。比色反应使用ABTS/H₂O₂氧化进行，各颜色的RGB值使用比色读数器测量。该检测方法展现出优异的灵敏度，在水相和加血样品中的检出限分别为0.268和0.328 ng/mL，定量限分别为0.89和1.09 ng/mL。当关键组分在适当条件（-20和4°C）下储存时，检测方法在长达一个月内表现出稳定的性能。尽管已有基于适配体的生物传感器用于CK-MB、cTnI、cTnT和肌红蛋白等心脏标志物的检测，但许多现有方法依赖多步扩增策略或复杂的纳米材料辅助信号转导。近期研究展示了适配体与RCA在心脏标志物检测中的整合，包括CK-MB。此外，适配体-RCA平台已被广泛探索用于cTnI检测，基于荧光的方法可达到pg/mL范围的超低检测限。然而，这些系统通常涉及复杂的荧光仪器和多组分纳米材料系统，可能限制其实际应用性。相比之下，本工作介绍了一种基于锁定适配体的HRCA策略，在简化系统中实现靶标诱导激活和信号扩增。虽然检测限在ng/mL范围，但该灵敏度与CK-MB临床相关浓度范围良好匹配，使该检测方法适用于实际诊断应用。此外，HRCA的使用提供了增强的信号扩增效率，而锁定适配体设计提高了特异性，为心脏标志物检测提供了一个稳健且直接的平台。"