《ACS Nutrition Science》：Effects of 5,7,3′,4′-Tetramethoxyflavone on Inflammatory Responses in Microglia and Lipopolysaccharide-Induced Neuroinflammation in Mice
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神经炎症是中枢神经系统对各种炎症刺激的免疫反应。该反应的异常激活参与了神经退行性疾病的发病机制，包括帕金森病和阿尔茨海默病。因此，调节异常的神经炎症被认为是预防神经退行性疾病的一种有前景的方法。本研究旨在探讨5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮（四甲基木犀草素，T
神经炎症是中枢神经系统对各种炎症刺激的免疫反应。该反应的异常激活参与了神经退行性疾病的发病机制，包括帕金森病和阿尔茨海默病。因此，调节异常的神经炎症被认为是预防神经退行性疾病的一种有前景的方法。本研究旨在探讨5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮（四甲基木犀草素，TML）——一种黄酮类化合物——在小鼠BV2小胶质细胞和小鼠模型中的抗炎活性。在脂多糖（LPS）诱导的炎症性BV2小胶质细胞中，TML显著抑制了白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO）的产生。它还抑制了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）（JNK， ERK， p38）的磷酸化和核因子-κB（NF-κB）的核转位。这些发现表明，TML的抗炎活性与MAPK和NF-κB信号通路的下调有关。在小鼠脂多糖诱导的神经炎症模型中，也观察到了TML抗炎活性的趋势。这些结果提示TML可能在预防神经炎症相关疾病中发挥作用。
**论文解读：5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮对神经炎症的抑制作用及其机制研究**
**研究背景与意义**
神经炎症已被广泛证实是阿尔茨海默病、帕金森病、缺血后脑损伤和抑郁症等多种中枢神经系统疾病进展的关键驱动因素。这些疾病与激活的小胶质细胞引起的过度或慢性炎症反应有关。这种异常的免疫反应导致促炎细胞因子和活性氧的过量产生，最终导致神经元功能障碍、细胞死亡和血脑屏障破坏。因此，抑制小胶质细胞的过度或慢性激活被认为是预防神经退行性疾病和神经炎性疾病的有效策略。食物中的抗炎营养素和非营养素因其化学多样性和较高的安全性，作为天然生物活性化合物备受关注。
黄酮类化合物已被报道可通过抑制小胶质细胞和巨噬细胞中促炎细胞因子和活性氧的产生而发挥有效的抗炎作用。然而，现有研究主要集中在羟基黄酮类化合物上，对不含羟基的甲氧基黄酮类（如川陈皮素）的研究有限。此外，关于其全面神经保护作用的报道较少，这些作用不仅包括体外炎症介质及其基因表达的验证，还包括体内炎症小鼠模型的研究以及与微胶质细胞激活相关的行为学变化。
本研究旨在评估从黑姜中发现的5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮（四甲基木犀草素，TML）的神经炎症抑制活性及其作为预防过度或慢性脑炎症的有效食物成分的潜力。该研究发表于《ACS Nutrition Science》。
**主要技术方法**
本研究采用体外细胞实验和体内动物模型相结合的方法。体外研究使用小鼠小胶质细胞系BV2细胞，通过脂多糖（LPS）诱导炎症模型。研究人员评估了TML对细胞活力（台盼蓝排斥试验）、葡萄糖代谢（基于WST-8的脱氢酶测定）、促炎细胞因子IL-6和TNF-α的分泌与转录（ELISA和实时定量PCR）、一氧化氮（NO）产生及其合成酶NOS2的转录（Griess法和实时定量PCR）、以及关键炎症信号通路MAPK（JNK， ERK， p38）磷酸化和NF-κB核转位（免疫印迹分析）的影响。体内研究使用ICR雄性小鼠（购自日本Clea公司），建立LPS诱导的急性神经炎症模型。通过旷场实验评估小鼠行为活动变化，并通过ELISA检测脑组织中IL-6水平，以探究TML口服给药（5.0和15 mg/kg，连续7天）的潜在改善作用。所有动物实验均遵循爱媛大学动物实验指南并获得批准。
**研究结果**
**TML对BV2细胞活力和葡萄糖代谢的影响**
研究首先通过台盼蓝排斥试验评估了TML对BV2细胞的细胞毒性。结果显示，浓度高达20 μM的TML处理6小时未表现出细胞毒性。基于此，后续实验使用20 μM或更低浓度的TML。接着，通过基于WST-8的脱氢酶测定法检测TML对LPS刺激的BV2细胞葡萄糖代谢的影响。LPS刺激导致吸光度显著增加，这归因于LPS刺激改变了BV2细胞的葡萄糖代谢，从而改变了NAD
+/NADH比率。当用20 μM TML处理LPS刺激的细胞时，吸光度降低至与未受LPS刺激的细胞相当的水平，表明TML可能抑制了与LPS刺激相关的葡萄糖代谢变化，从而发挥抗炎作用。
**TML对LPS诱导的BV2小胶质细胞促炎细胞因子产生和转录的调节作用**
研究发现，TML以浓度依赖的方式显著抑制LPS诱导的IL-6和TNF-α的分泌及其mRNA的转录。具体而言，TML在浓度≥2.5 μM时显著抑制IL-6的分泌和转录；在浓度≥5 μM时显著抑制TNF-α的分泌，在浓度≥10 μM时显著抑制其转录。这表明TML通过抑制mRNA转录来减少这些促炎细胞因子的产生。
**TML对LPS诱导的BV2细胞NO产生和NOS2转录的调节作用**
研究进一步探讨了TML对NO产生及其关键合成酶——诱导型一氧化氮合酶（NOS2）转录的影响。结果显示，TML以浓度依赖的方式显著抑制LPS和干扰素-γ（IFN-γ）诱导的NO产生，在20 μM时抑制率约达90%。同时，TML在浓度≥10 μM时显著抑制NOS2的转录。
**TML对LPS刺激的BV2细胞内信号通路的影响**
为阐明TML的抗炎分子机制，研究人员检测了其对MAPK和NF-κB信号通路的影响。免疫印迹分析显示，LPS刺激显著增加了JNK、ERK和p38的磷酸化，而20 μM TML处理显著减弱了这种磷酸化。此外，LPS刺激显著促进了NF-κB的核转位，而TML处理则显著抑制了这一过程。这些结果表明，TML的抗炎作用与其下调MAPK和NF-κB信号通路的激活有关。
**TML对LPS诱导神经炎症小鼠行为改变的影响**
通过旷场实验评估TML对LPS诱导脑炎症小鼠行为活动的影响。结果显示，LPS注射导致对照组小鼠的活动水平下降约35%。相比之下，高剂量TML（15 mg/kg）给药组小鼠的活动水平下降幅度限制在约25%，表明TML有改善LPS诱导的脑炎症相关行为障碍的趋势。
**TML对LPS诱导的小鼠脑内IL-6产生的影响**
研究人员还检测了小鼠脑组织中IL-6的水平。发现LPS注射升高了脑内IL-6水平，而TML给药组（特别是高剂量组）小鼠的脑内IL-6水平呈现低于LPS对照组的趋势，进一步支持了TML在体内可能具有抗神经炎症的潜力。
**讨论与结论**
本研究旨在探讨TML对小胶质细胞炎症反应的抑制作用及其分子机制。讨论部分指出，TML能显著抑制BV2细胞中关键促炎介质（IL-6、TNF-α、NO）的产生及其mRNA转录，并通过同时靶向NF-κB和MAPK（ERK、JNK、p38）信号通路，发挥多靶点抑制小胶质细胞活化的作用。WST-8脱氢酶测定结果提示，TML可能通过抗炎作用，抑制了LPS诱导的瞬时高代谢和/或线粒体活性增强。尽管已有一些甲氧基黄酮具有抗炎活性的报道，但大多数研究集中于巨噬细胞等外周组织，对微胶质细胞中分子机制的详细分析有限。因此，本研究为甲氧基黄酮靶向微胶质细胞多炎症信号通路的潜力提供了关键见解。
NF-κB和MAPK是炎症信号转录和翻译控制的核心，它们协同增强细胞因子的产生。TML抑制NF-κB核转位，提示其可能直接或间接抑制IκB降解或Toll样受体4（TLR4）信号传导。TML对JNK、ERK和p38磷酸化的抑制表明其可能作用于炎症信号的上游。同时抑制NF-κB和MAPK信号通路有助于在微胶质细胞中产生更强的抗炎效果。然而，TML是否作用于炎症信号上游仍是推测性的，需要进一步研究阐明其靶分子的存在和定位，及其与TLR4的相互作用和对上游激酶（如TAK1和IRAK1）的调节。
体内实验表明，TML有改善LPS诱导的脑炎症小鼠行为活动下降的趋势，并提示其可能降低脑内IL-6水平。尽管未达到统计学显著性，但考虑到急性LPS模型中炎症的强度和样本量，这些结果暗示TML可能在生物学水平上发挥作用。在急性炎症模型中，炎症的快速和瞬时增加使得难以清晰观察抗炎物质的效果。本研究中使用的7天给药期可能不足以充分评估食物来源成分的作用。虽然某些甲氧基黄酮已被证明可以穿过血脑屏障到达大脑，但TML是否具有足够的脑渗透性以发挥其作用仍有待确定。未来需要进行实验以量化大脑中的TML浓度。此外，行为评估受显著的生物变异影响。因此，通过增加样本量、延长口服给药时间以及采用慢性神经炎症模型（如慢性LPS诱导或阿尔茨海默病模型），可能会获得更明确的结果。
本研究存在一些局限性：首先，BV2细胞是永生化的小胶质细胞，可能无法完全再现原代小胶质细胞的生理特性；其次，TML的血脑屏障渗透性尚未明确表征；第三，尽管体内结果未达到统计学显著性，但这主要归因于实验设计中可修改的因素；最后，TML的具体分子靶点尚未确定，需要进一步进行分子机制分析。
**研究结论部分翻译如下：**
总之，本研究证明TML通过调节BV2细胞中的NF-κB和MAPK信号通路，对微胶质细胞神经炎症产生有效的抑制作用。鉴于体内行为恢复和炎症标志物改善的趋势，表明TML可能在生物学水平上有助于抑制神经炎症。研究结果表明，TML具有作为预防各种神经炎性疾病（包括阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症和缺血性脑损伤）策略的潜力。未来的研究将为TML的营养保健和功能特性提供更深入的见解。
