从全蛋白质组孟德尔随机化(Mendelian randomization, MR)与多组学整合到功能验证：TGFB3作为胃腺癌(gastric adenocarcinoma)优先候选靶点的研究
《Frontiers in Oncology》：From proteome-wide Mendelian randomization and multi-omics integration to functional validation: TGFB3 as a prioritized candidate in gastric adenocarcinoma
摘要：引言：胃腺癌(gastric adenocarcinoma)缺乏可靠的循环生物标志物和可成药靶点。研究人员评估了遗传预测的血浆蛋白水平是否影响疾病风险，并利用全蛋白质组孟德尔随机化(two-sample MR)框架寻找可成药候选靶点。方法：研究人员将deCODE血浆蛋白定量性状位点(protein quantitative trait loci, pQTLs)与胃癌全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)整合至全蛋白质组两样本MR框架中，以鉴定与胃癌存在因果关联的循环蛋白。利用蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)拓扑结构优先筛选出8个枢纽(hub)蛋白，并通过八基因人工神经网络(artificial neural network, ANN)分类器进一步评估。结合单细胞(single-cell)和空间转录组(spatial transcriptomics)及多重免疫荧光(multiplex immunofluorescence)技术，绘制hub基因在上皮、基质及免疫区室中的表达分布。最终聚焦遗传与空间共同优先的TGFB3靶点，联合虚拟筛选(in silicoligand screening)与proflavine hemisulfate（半硫酸原黄素）作为化学探针进行in vitroTGFB3–PI3K生存轴扰动实验。结果：全蛋白质组MR突出显示29个对胃癌具假定因果效应的循环蛋白，其中8个(ERBB3, LGR4, BMP4, CD248, MGP, TGFB3, GRP和ETS2)位于互作网络中心位置。相应八基因ANN在多个队列中对胃癌与正常组织具稳健判别力，诊断效能优于临床变量。单细胞、空间及多重免疫荧光分析将这些hubs定位于上皮、成纤维细胞和内皮区室，TGFB3富集于肿瘤-基质界面且与不良生存相关。虚拟筛选提名TGFB3结合配体，半硫酸原黄素在in silico中与TGFB3形成稳定复合物，并在AGS细胞中减弱TGFB3驱动的增殖、迁移及PI3K依赖的生存信号。结论：该全蛋白质组MR框架识别出促成胃致癌过程的遗传支持的循环蛋白，并聚焦于TGFB3作为可操作的基质信号轴。半硫酸原黄素是胃癌细胞中TGFB3–PI3K生存信号通路的机制性信息化学探针，为未来TGFB3靶向治疗策略提供起始骨架。
论文解读——《From proteome-wide Mendelian randomization and multi-omics integration to functional validation: TGFB3 as a prioritized candidate in gastric adenocarcinoma》发表于《Frontiers in Oncology》
一、研究背景与概述
胃癌尤其是胃腺癌(gastric adenocarcinoma)是全球范围内高致死性恶性肿瘤，早期诊断率低、肿瘤异质性强、晚期治疗响应有限。现有血清标志物敏感性与特异性不足，分子分型亦未能完全覆盖其生物学异质性。循环血浆蛋白可反映全身生理与局部肿瘤微环境状态，但观察性蛋白关联易受反向因果与混杂因素影响。蛋白质定量性状位点(protein quantitative trait loci, pQTL)指导的孟德尔随机化(Mendelian randomization, MR)可利用生殖系遗传变异作为工具变量，推断遗传预测蛋白丰度与疾病的因果关联，降低混杂与反向因果偏倚。本研究通过全蛋白质组MR筛选与胃癌风险因果相关的循环蛋白，经蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络拓扑优先获得hub基因，结合人工神经网络(artificial neural network, ANN)、单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)、空间转录组(spatial transcriptomics)、多重免疫荧光(multiplex immunofluorescence, mIF)及体外功能实验，对候选靶点TGFB3进行多层级验证与化学探针初步探索，旨在发现具诊断、预后价值的循环蛋白候选靶点与可干预的肿瘤微环境信号轴。
二、主要关键技术方法概括
研究人员采用的主要方法包括：(1)两样本MR——以deCODE血浆pQTL（冰岛人群，n=35,559，4,907个适配子检测蛋白）为暴露，胃癌GWAS（IEU数据库 ebi-a-GCST90435577，欧洲裔393,926人；独立验证用欧洲大样本GWAS ebi-a-GCST90018849及东亚BioBank Japan bbj-a-119）为结局，逆方差加权(inverse-variance weighted, IVW)为主估计，Benjamini-Hochberg校正FDR<0.05，辅以MR-Egger、MR-PRESSO、留一法及Steiger过滤；(2)PPI网络构建与中心性分析——STRING数据库建网，Cytoscape+cytoHubba按度中心性(degree centrality)与边渗滤分量(Edge Percolated Component, EPC)取交集获8个网络优先基因；(3)八基因ANN分类器——输入层8节点、单隐层（最优5神经元）、softmax输出，重复10折交叉验证及1,000次bootstrap乐观校正，SHAP(kernel SHAP)解释特征贡献，外部验证用GEO数据集(GSE54129/GSE26899/GSE13911)；(4)scRNA-seq与空间转录组——Seurat处理GSE163558胃癌标本（9例肿瘤），Harmony批次校正，SingleR注释；空间转录组GSE251950用CARD解卷积，Global Moran's I检验空间自相关；(5)细胞-细胞通讯与拟时分析——CellChat推断配体-受体互作，Monocle2做探索性拟时轨迹；(6)NicheNet与scTenifoldKnk——成纤维细胞为发送细胞、上皮细胞为接收细胞做配体-受体推断，TGFBR2虚拟敲除看转录扰动；(7)虚拟筛选与分子对接——ZINC数据库小分子经Schr?dinger LigPrep/AutoDock Vina/Glide对接TGFB3，100 ns分子动力学(molecular dynamics, MD)模拟(GROMACS, AMBER99SB-ILDN, MM/GBSA)；(8)in vitro功能实验——人胃癌AGS细胞系，CCK-8测IC50，EdU克隆形成、Transwell侵袭、伤口愈合、Annexin V-APC/PI流式凋亡检测，Western blot检测cleaved Caspase-3、BAX、BCL2及p-PI3K(protein kinase B downstream phosphatidylinositol 3-kinase)/总PI3K，重组人TGFB3(rhTGFB3)与proflavine hemisulfate(PFH)共处理。
三、研究结果
3.1 MR analysis of circulating plasma proteins associated with GC（胃癌相关循环血浆蛋白的MR分析）
通过全蛋白质组两样本MR分析4,907个血浆蛋白，29个蛋白FDR<0.05与胃癌风险存在因果关联，其中SPINK2、TGFB3、LGR4、CD248、BMP4、MGP、GRP、ETS2等升高关联风险升高，PCDH10、ERBB3等升高关联风险降低。在欧洲与东亚独立GWAS中效应方向一致，敏感性分析（MR-Egger截距P>0.05、Cochran's Q无显著异质性、MR-PRESSO无非离群、留一法无单SNP驱动）支持结果稳健。
3.2 Functional annotation and pathway enrichment analysis（功能注释与通路富集分析）
GO分析显示29个MR关联蛋白富集于上皮生长分化、ErbB信号及蛋白酶活性调节；KEGG富集于ErbB、MAPK、TGF-β信号通路及胃癌相关通路，提示其参与上皮状态调控与基质重塑。
3.3 Exploratory PPI network construction and network-based candidate prioritization（PPI网络构建与基于网络的候选基因优先排序）
STRING构建29蛋白PPI网络，取degree与EPC排名前10的交集，获8个拓扑优先hub基因：ERBB3、LGR4、BMP4、CD248、MGP、TGFB3、GRP、ETS2。
3.4 Construction and validation of the GC ANN predictor（胃癌ANN预测模型构建与验证）
八基因MLP在TCGA-STAD训练集表观AUC=0.998，重复10折交叉验证AUC=0.913，bootstrap校正AUC=0.908；锁定模型应用于GSE54129(AUC=0.953)、GSE26899(AUC=0.837)、GSE13911(AUC=0.819)。优于同期比较的logistic回归、LASSO、岭回归及随机森林；加入ANN基因评分使临床仅模型(AUC≈0.57)升至≈0.79(DeLong's test P<0.05)，评分本身为肿瘤状态独立预测因子(OR~6.9)。
3.5 SHAP-based interpretability of the GC classifier（基于SHAP的GC分类器可解释性）
全局平均|SHAP|显示CD248贡献最大，依次为ERBB3、LGR4、MGP、TGFB3、GRP、BMP4、ETS2；依赖图揭示非线性与交互调制效应（如ERBB3/LGR4受CD248调制，TGFB3/GRP受MGP调制）；五轮重训与bootstrap重抽样SHAP排序稳定(Spearman ρ中位数0.85)，说明特征贡献具重现性。SHAP重要性不与单基因Cox危险比单调相关，表明分类贡献不同于预后效应。
3.6 Cell type–specific expression in gastric tumor tissues（胃肿瘤组织中细胞类型特异性表达）
scRNA-seq注释8大类群（T细胞、中性粒细胞、上皮细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞、增殖细胞、内皮细胞）。ERBB3主要在上皮细胞高表达；CD248、TGFB3主要在成纤维细胞高表达；MGP在成纤维与内皮细胞；LGR4在上皮与成纤维细胞中等表达；BMP4低上皮表达；GRP极低纤维细胞表达；ETS2在中性粒细胞、上皮、巨噬及内皮较高。
3.7 Cell–cell communication and pseudotime trajectory analysis（细胞-细胞通讯与拟时轨迹分析）
CellChat推断巨噬细胞?上皮细胞、成纤维细胞→上皮细胞、成纤维细胞→内皮细胞间配体-受体互作较强。Monocle2拟时分析显示各细胞类型沿转录状态轴分布不同(Kruskal-Wallis P<2.2×10-6)，CD248(成纤维)、LGR4(上皮/成纤维)、ERBB3(上皮)与拟时呈正相关，ETS2(巨噬/中性粒)呈负相关——仅作探索性转录状态连续体解读。
3.8 Spatial transcriptomic analysis of hub gene expression within gastric cancer（胃癌中hub基因表达的空间转录组分析）
两例胃癌空间转录组切片中8个hub基因均呈显著正空间自相关(Global Moran's I, FDR<0.05)，MGP与ERBB3空间聚集最强，TGFB3虽弱但仍显著，表明表达在组织中非随机分布。
3.9 Survival analysis of GC network-prioritized genes（GC网络优先基因生存分析）
Kaplan–Meier Plotter显示高表达BMP4(HR=1.39)、CD248(HR=1.48)、GRP(HR=1.47)、LGR4(HR=1.46)、MGP(HR=1.49)、TGFB3(HR=1.71)关联较差总生存；高表达ERBB3(HR=0.69)、ETS2(HR=0.60)关联较好总生存。ANN预测概率pANN高值亦关联较短OS(P=0.006)。
3.10 Validation of specific expression of network-prioritized genes in TME in human GC samples（人GC样本中网络优先基因在TME中的特异性表达验证）
mIF证实：BMP4蛋白共定位Pan-CK+上皮细胞；CD248与TGFB3共定位FAP+癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)；LGR4见于Pan-CK+上皮与FAP+CAF；MGP见于CD31+内皮结构与FAP+CAF-rich基质——与转录组推断吻合。综合MR关联、网络中心性、不良预后、成纤维富集及肿瘤-基质界面空间定位，选定TGFB3深入表征。
3.11 Virtual screening of candidate compounds from the ZINC database（ZINC数据库候选化合物虚拟筛选）
对TGFB3进行ZINC虚拟筛选→Schr?dinger Glide高精度对接，前五名Glide GScore≤-8.3 kcal/mol，最优为Proflavine hemisulfate(-9.323 kcal/mol)，次为Hydroxychloroquine sulfate(-9.215)、Rizatriptan benzoate(-8.845)、L-Histidine(-8.378)、Retigabine(-8.327)。Proflavine hemisulfate与Tyr178/Cys180形成π-π堆积，与Glu223/Thr221/Ser127形成分叉氢键网络。
3.12 Molecular docking prediction of TGFB3 binding to …（TGFB3与候选分子对接预测）
AutoDock Vina对接显示五者结合能均<-7.0 kcal/mol（Proflavine hemisulfate -9.346 kcal/mol最强），证实均可强结合TGFB3口袋。
3.13 Validation of binding stability and intermolecular interactions for the TGFB3–proflavine hemisulfate complex（TGFB3–Proflavine半硫酸盐复合物结合稳定性验证）
100 ns MD显示复合物RMSD 20 ns后收敛(0.20–0.30 nm)，Rg稳定(4.75–5.12 nm)，SASA~900–940 nm2，PCA自由能面存两个低能阱(ΔG≈2–4 kJ/mol)，残基协方差热图示结合口袋局部动态被配体稳定化——提示复合物理想构象稳定性。
3.14 PFH effectively inhibits the proliferation of AGS gastric cancer cells（PFH有效抑制AGS胃癌细胞增殖）
CCK-8得PFH对AGS细胞24 h IC50=8.851 μM；EdU掺入阳性率下降，克隆形成数/大小减少——证明PFH削弱AGS增殖能力。
3.15 PFH attenuates the migratory and invasive capacities of AGS cells while promoting apoptosis（PFH减弱AGS细胞迁移侵袭并促进凋亡）
划痕实验PFH延迟创口闭合，Matrigel Transwell侵袭细胞数减少，Annexin V/PI双染凋亡比例升高——表明PFH抑制转移表型并促凋亡。
3.16 PFH shifts the apoptotic balance and suppresses TGFB3-induced PI3K activation in AGS cells（PFH偏移凋亡平衡并抑制TGFB3诱导的PI3K活化）
rhTGFB3使cleaved Caspase-3↓、BAX↓、BCL2↑（促存活），p-PI3K/PI3K↑；PFH逆转此趋势（cleaved Caspase-3↑、BAX↑、BCL2↓，p-PI3K下调），且不影响总PI3K与GAPDH——提示PFH选择性拮抗TGFB3-PI3K生存信号。
3.17 Computational characterization of a putative fibroblast–epithelial TGFB3 signaling route（推定成纤维细胞-上皮细胞TGFB3信号通路的计算表征）
NicheNet将TGFB3列为成纤维→上皮潜在配体，推定上皮受体含TGFBR2；单细胞水平TGFB3与TGFBR2表达正相关(Spearman ρ=0.041, P<0.001)。上皮TGFBR2虚拟敲除(scTenifoldKnk)引起TGF-β/SMAD、MAPK–PI3K–mTOR–ERBB、细胞周期、凋亡–p53、ECM–黏附、血管生成及炎症相关基因显著扰动——支持成纤维细胞来源TGFB3经TGFBR2影响上皮转录程序的计算假说。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出：八hub基因各有文献佐证——ERBB3在胃癌膜过表达促恶但在循环中高水平关联低风险（可能反映可溶性sHER3保护性）；ETS2低表达关联侵袭表型；余六基因为促肿瘤（BMP4-EMT、CD248-CAF/ECM重塑、GRP-自分泌促增殖、LGR4-Wnt/β-catenin干性、MGP-基质活化、TGFB3-免疫抑制/EMT）。ANN具跨队列判别力但SHAP≠预后危险比，模型受随机初始化轻微影响需谨慎外推。scRNA-seq、空间转录组与mIF互相印证hub基因区室特异性。TGFB3选为深入对象因其MR信号、网络位置、不良预后、成纤维富集及适于结构计算。虚拟筛选与MD提示Proflavine hemisulfate(PFH)可稳结合TGFB3，in vitroPFH拮抗rhTGFB3诱导的AGS增殖/迁移/抗凋亡及PI3K磷酸化。NicheNet+TGFBR2虚拟敲除支持成纤维TGFB3→上皮TGFBR2旁分泌轴。作者强调PFH为化学探针/老药新用先导而非即期治疗药物（具DNA嵌入特性与潜在遗传毒性，需后续选择性、PK/PD及in vivo验证）。研究局限含MR未达Bonferroni严格阈值、胃癌GWAS病例数偏少、pQTL主要来自冰岛人群、scRNA-seq样本量有限、PPI与细胞通讯推断非直接测量、TGFB3功能仅在单一上皮株外源处理验证未做成纤维条件培养基/共培养/in vivo。
结论（翻译）：
本研究整合全蛋白质组孟德尔随机化、人工神经网络建模、SHAP解释、单细胞与空间转录组分析、虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟及in vitro实验，探讨循环血浆蛋白与胃癌的关系。该整合框架优先出八个具遗传支持关联及互补表达、细胞、空间与临床证据的候选基因——ERBB3、LGR4、BMP4、CD248、MGP、TGFB3、GRP和ETS2，八基因特征在评估的回顾性队列中显示可重复的诊断判别力。其中TGFB3被选作深入表征对象，在测试条件下proflavine hemisulfate减弱了重组TGFB3暴露后的部分表型及信号响应。综上，这些发现提供了一个受遗传信息及多组学支持的候选生物标志物与信号因子集合，可供胃癌进一步诊断、预后及治疗探索。
