菊苣（Cichorium intybus L.）多糖通过微生物群-HDCA-TGR5-Akt-NF-κB信号轴改善断奶仔猪生长性能与结肠屏障功能：FMT及体外模型的验证

《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Cichorium intybus L. polysaccharide improves growth performance and colonic barrier function in weaned piglets via the microbiota-HDCA-TGR5-Akt-NF-κB signaling axis: validation by FMT and in vitro models

　　

断奶应激易导致仔猪发生肠道屏障破坏与肠道菌群失调（gut dysbiosis），进而引发断奶后腹泻与饲料效率低下。菊苣（Cichorium intybus L.）多糖（CLP）是一种富含果聚糖（fructan）的益生元候选物，然而CLP如何通过重塑微生物群-代谢物网络以保护结肠尚不清楚。方法：实验1中，96头断奶仔猪[杜洛克×(长白×大约克)，28日龄，8.03±0.2 kg]分别饲喂基础日粮（CON组）或添加0.5% CLP的日粮（CLP组）。实验2中，将仔猪粪便微生物群移植（FMT）至葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠体内，以验证CLP重塑后微生物群的因果作用。采用宏基因组学和非靶向代谢组学分析鉴定关键微生物物种与功能性代谢物。实验3中，Caco-2细胞经不同浓度猪去氧胆酸（HDCA）处理24 h，功能性验证其对TGR5⁺和FXR⁺表达水平的调控作用。结果：日粮添加CLP显著降低料重比、腹泻率和组织学指数（P<0.05），并增加杯状细胞数量（P<0.05）。宏基因组测序显示CLP显著提高微生物α-多样性并重塑群落结构，尤其富集Blautia sp.、Eubacterium sp.和Ruminococcus sp.等有益微生物。为验证微生物群因果性，将CON或CLP组仔猪粪便微生物群移植至抗生素处理小鼠后进行DSS攻毒。CLP修饰的微生物群缓解DSS诱导的结肠炎，上调Occludin和ZO-1表达，并降低结肠IL-1β和TNF-α水平。机制上，CLP重塑的微生物群促进HDCA积累，HDCA作为信号配体激活结肠TGR5受体，该激活随后抑制Akt磷酸化（P<0.05），进而通过降低IκBα和p65亚基的磷酸化抑制NF-κB信号通路（P<0.05），从而有效消除炎症反应。结论：日粮添加CLP通过重塑结肠微生物群，尤其富集HDCA产生菌，缓解断奶诱导的肠道损伤与炎症。HDCA-TGR5-Akt信号轴的后续激活抑制NF-κB通路，从而改善宿主免疫应答和肠道屏障功能。

该论文发表于《Journal of Animal Science and Biotechnology》，旨在探究饲粮添加菊苣（Cichorium intybus L.）多糖（CLP）对断奶仔猪结肠健康的保护作用及其分子机制，为开发新型功能性饲料添加剂提供理论依据。

**研究背景与现存问题**

断奶是养猪生产中最具挑战性的阶段之一，涉及社会、环境和营养条件的急剧变化，常引发断奶应激综合征（weaning stress syndrome），表现为严重肠道屏障功能障碍、生长性能急剧下降及断奶后腹泻高发。断奶期间，仔猪未成熟的肠道极易发生菌群失调（dysbiosis）和急性炎症，伴随促炎信号通路的过度激活。传统上，抗生素被用于缓解上述问题，但全球对抗生素生长促进剂的限制加剧了寻找可持续功能性饲料添加剂的需求。天然植物源性多糖因其低毒性和多靶点生物许愿活性而作为益生元（prebiotics）受到关注。菊苣多糖（CLP）是一种主要由果糖单元组成的复杂碳水化合物，近期研究表明其具有免疫调节和抗氧化特性。与传统营养素不同，这类多糖可完整到达大肠，作为有益微生物的选择性底物，从而调节肠道微生物组成并影响宿主免疫应答。尽管前期研究已注意到CLP可改善生长性能，但CLP重塑的微生物群如何与宿主信号协调以缓解断奶应激的具体机制尚待充分阐明。肠道微生物群作为关键代谢器官，将膳食纤维转化为与宿主组织沟通的生物活性代谢物，其中次级胆汁酸（secondary bile acids, SBAs）已被鉴定为这一串扰中的关键信号分子，而猪去氧胆酸（HDCA）作为猪肠肝循环中的主要SBA，其通过G蛋白偶联受体TGR5发挥抗炎作用的机制日益受到重视。基于此，研究人员假设CLP通过重塑结肠微生物群、促进HDCA产生，进而激活TGR5通路抑制NF-κB介导的炎症，从而改善断奶仔猪肠道屏障功能。

**主要关键技术方法**

本研究采用三个递进实验相结合的策略：实验1为断奶仔猪饲养试验，96头杜洛克×(长白×大约克)断奶仔猪随机分为对照组和0.5% CLP添加组，饲养28天，测定生长性能、腹泻率、结肠组织学及炎症指标；实验2建立伪无菌（PGF）小鼠粪菌移植（FMT）模型，将仔猪粪便微生物群移植至抗生素预处理后的小鼠，再进行DSS诱导的结肠炎攻毒，验证微生物群的因果作用；实验3采用人结肠上皮Caco-2细胞系进行HDCA刺激试验，结合分子对接技术验证HDCA对TGR5和FXR的调控。检测技术包括：宏基因组测序分析微生物群落、非靶向代谢组学鉴定差异代谢物、RNA测序和RT-qPCR分析基因表达、Western blot检测蛋白磷酸化水平、免疫荧光（含TSA酪胺信号放大技术）检测紧密连接蛋白、ELISA测定炎症因子及MPO活性。

**研究结果**

**CLP对断奶仔猪生长性能、腹泻率、结肠形态及炎症因子的影响**：日粮添加0.5% CLP在试验第14-28天及全期显著降低料重比（P<0.05，P=0.01），全期有提高平均日增重的趋势（P=0.09），对各阶段采食量无显著影响。CLP显著降低试验各阶段腹泻率（P<0.05），改善结肠黏膜结构，降低组织学指数（P<0.05），增加杯状细胞数量（P<0.05）。在结肠组织中，CLP降低IL-1β含量和MPO活性（P<0.05），提高IL-10含量（P<0.05），IL-6含量升高（P<0.05），TNF-α无显著变化。营养物质的表观全肠道消化率组间无显著差异。

**CLP重塑断奶仔猪结肠微生物群**：宏基因组测序显示，CLP显著提高微生物α-多样性（Shannon指数升高、Simpson优势度指数降低，P<0.05），β-多样性分析（PCoA）显示群落结构显著分离（ANOSIM R=0.467, P=0.003）。差异丰度分析（指示分析和LEfSe）鉴定出CLP组富集多种纤维相关分类群，如Blautia sp.、Eubacterium sp.、Agathobacter sp.、Ruminococcus sp.和Clostridium sp.，同时Escherichia coli丰度降低，Lactobacillus johnsonii相对丰度显著下降。

**CLP仔猪来源FMT缓解DSS诱导的小鼠结肠炎并调控TGR5-Akt-NF-κB轴**：与FMT_Con组相比，FMT_CLP组小鼠DSS攻毒后体重损失减轻，疾病活动指数（DAI）降低（P<0.05），结肠缩短缓解（P<0.05）。组织学显示组织损伤减轻，杯状细胞增加（P<0.05）。屏障标志物Occludin、ZO-1和MUC2表达增加，MPO活性和促炎因子IL-1β、TNF-α降低，IL-10升高（P<0.05）。转录组分析显示FMT两组间共有2,232个差异表达基因（DEGs），KEGG富集于PI3K-Akt信号通路。RT-qPCR和Western blot验证Tgr5（Gpbar1）和Fxr表达增加，Akt、IκBα和p65的磷酸化水平降低（P<0.05），提示Akt和NF-κB活化受抑。分子对接显示HDCA与TGR5的结合亲和力（-8.8 kcal/mol）强于FXR（-6.8 kcal/mol）。Caco-2细胞试验证实，不同浓度HDCA处理24 h可剂量依赖性上调TGR5⁺和FXR⁺的mRNA水平，其中TGR5⁺相对表达水平更高（P<0.05）。

**CLP相关的代谢特征**：非靶向代谢组学在仔猪和受体小鼠中均显示组间显著分离，16种差异代谢物在两数据集中重叠，其中HDCA在CLP仔猪和FMT_CLP受体小鼠中一致升高。KEGG富集分析显示差异代谢物主要涉及消化吸收和胆汁酸相关通路。

**讨论部分总结**

研究人员讨论指出，CLP改善饲料效率和结肠屏障功能但不改变营养消化率，表明其积极作用与肠道生态系统调节、缓解炎症相关代谢负担有关，而非营养性供能。CLP促进的生态演替是从哺乳期不成熟菌群向更成熟的纤维发酵菌群的优化转变，Lactobacillus johnsonii的减少不应视为有益菌的丧失，而是增强植物性日粮代谢和抗炎代谢物产生能力的结构优化。FMT试验建立的因果链证实了微生物群介导的代谢活性对宿主保护的根本作用，HDCA作为关键功能代谢物通过TGR5而非FXR发挥主导作用——这一选择性由分子对接的亲和力差异和TGR5蛋白水平的显著上调共同支持。HDCA激活TGR5后抑制PI3K-Akt-NF-κB级联反应，通过稳定IκBα、减少其泛素化降解，并抑制p65 Ser536磷酸化以阻断核转位，最终抑制促炎细胞因子产生和中性粒细胞浸润。该机制与其他高效生物活性多糖的抗炎效应相呼应，但CLP通过特异性靶向TGR5-Akt-NF-κB轴提供了更精确的作用框架。

**研究结论**

日粮添加CLP有效缓解仔猪的断奶应激和结肠炎症。这些有益效应与重塑的肠道微生物群和增加的HDCA产生相关，HDCA随后激活结肠TGR5-Akt-NF-κB信号通路，这一点已在PGF小鼠和体外模型中得到验证。研究结果支持CLP作为促进断奶过渡期肠道健康的功能性饲料添加剂的潜力。