《BMC Methods》：Ready to GO: a reliable and reproducible method for preparing graphene oxide grids using the Vitrobot
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背景：冷冻电子显微镜（Cryo-Electron Microscopy, CryoEM）通过在近天然状态下可视化大分子，彻底改变了结构生物学。然而，诸如颗粒与气水界面（Air-Water Interface, AWI）的相互作用、优势取向以及光束诱导运动等挑战
背景：冷冻电子显微镜（Cryo-Electron Microscopy, CryoEM）通过在近天然状态下可视化大分子，彻底改变了结构生物学。然而，诸如颗粒与气水界面（Air-Water Interface, AWI）的相互作用、优势取向以及光束诱导运动等挑战限制了该技术的分辨率和可重复性。氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）已成为解决这些挑战的一种极具前景的支撑材料。
方法：在此，研究人员提出了一种优化的方法，用于使用广泛使用的CryoEM样品制备设备Vitrobot Mark IV制备GO支撑载网。这种改进的滴铸方案采用聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine, PEI）来增强GO的粘附力，并通过使用Vitrobot Mark IV精确控制环境和 blotting（吸墨/ blotting）参数来确保可重复性。
结果：使用该方法制备的载网表现出平均55%的GO覆盖率，其中单层（monolayer）和双层（bilayer）覆盖率占40%。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）和脱铁蛋白（apoferritin）的CryoEM重构分别达到了2.3 ?和1.9 ?的分辨率，证明了该方法用于高分辨率结构测定的可行性。
讨论：这种基于Vitrobot的方法提供了一种简单且可重复的制备GO支撑载网的方法，无需专用设备。受控的环境设置和PEI增强的GO粘附确保了稳定的载网质量和颗粒分布。该方案支持高分辨率重构，并为未来的应用（包括功能化和对具有挑战性的样品的研究）提供了实用的基础。
论文解读：基于Vitrobot的氧化石墨烯冷冻电镜载网标准化制备方案
研究背景
自分辨率革命以来，冷冻电子显微镜（Cryo-Electron Microscopy, CryoEM）已成为阐明蛋白质结构的关键方法。然而，当前的样品制备过程仍面临诸多挑战，严重制约了成像质量与结构的解析能力。首先，气水界面（Air-Water Interface, AWI）作为一种疏水表面，会导致蛋白质变性、破坏大分子复合物或诱导优势取向（preferential orientation）。其次，当样品应用于无支撑的电镜载网时，颗粒往往会吸附在金属箔材料（如金或碳）上，导致孔洞内分布稀疏或在孔边缘聚集。此外，玻璃化冰层（vitrified ice layer）的厚度对高分辨率成像至关重要，过薄或过厚均会影响结构细节，而传统的滤纸吸墨（blotting）过程因纸张纤维表面的不规则性，会导致冰厚度变化，影响可重复性。最后，光束诱导运动（beam-induced motion）和电荷积累也是阻碍高分辨率CryoEM的重要因素。氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）因其电子透明性、高导电性和机械强度，被视为理想的载网支撑材料，能够减少AWI面积、提供均匀支撑表面并减轻上述成像障碍。然而，现有的GO载网制备方法（如表面组装法）通常需要专用设备，而传统的滴铸法（drop cast method）则容易因实验室条件和操作人员差异导致批次间质量不一致。因此，开发一种简便、低成本且高度可重复的GO载网制备方案具有重要的实用价值。该研究发表于《BMC Methods》。
主要关键技术方法
研究人员采用改进的四步序贯滴铸流程，利用Vitrobot Mark IV在恒温恒湿环境下的精密可编程控制能力，实现了GO的标准化沉积。关键步骤包括：首先对Quantifoil或UltrAufoil载网进行辉光放电（glow discharge）处理以增强亲水性，随后利用玻璃移液管滴加氯仿（chloroform）进行清洁；接着，在Vitrobot腔内依次完成四项操作：第一步滴加聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine, PEI）溶液以修饰载网表面，等待120秒后吸墨；第二步滴加双蒸水（ddH2O）清洗多余PEI后立即吸墨，再等待120秒干燥；第三步滴加GO分散液，等待120秒使其充分附着后吸墨；第四步再次滴加ddH2O清洗未结合的GO并立即吸墨取出。载网取出后在滤纸上干燥至少5分钟即可用于后续实验。该方法的核心在于通过设备严格控制温度、湿度及每一步的等待与吸墨时间，消除了人为操作的变量。
研究结果
Preparation of GO grids by drop cast method using Vitrobot
通过使用Vitrobot Mark IV实施上述四步法，研究人员成功制备了高质量的GO载网。尽管经历了多次吸墨步骤，载网并未受到明显损坏，仅有极少数位于边缘的孔出现破裂，这归因于GO应用后采用了较低的吸墨力度。最终制备的载网平均GO覆盖率约为55%，其中单层（monolayer）和双层（bilayer）覆盖率合计达到40%。重要的是，这种覆盖在整个载网上均匀分布，而非集中在某一区域。通过对Quantifoil（铜网）和UltrAufoil（金网）两种不同材料的测试发现，两者在GO覆盖率和层数分布上表现相似，证明了该协议在不同材质载网上的通用性与稳健性。
Single particle cryoEM on GO grids
为了验证GO载网的实际成像性能，研究人员对β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）和脱铁蛋白（apoferritin）进行了单颗粒分析（Single-Particle Analysis, SPA）。结果表明，颗粒在载网孔内的分布十分均匀。值得注意的是，所使用的脱铁蛋白浓度仅为常规多孔碳载网所用浓度的四分之一，这表明GO层有效减少了颗粒向AWI的损失。三维（3D）重构结果显示，β-半乳糖苷酶和脱铁蛋白分别达到了2.33 ?和1.89 ?的高分辨率。即使在含有五层或更多层GO的区域，依然能够成功拾取颗粒并获得高质量图像，这说明多层GO覆盖并不会损害图像质量。此外，二维（2D）分类不仅揭示了清晰的内部结构细节，还能够通过分类有效排除位于GO片层边缘带有伪影的颗粒。除了标准样品，该GO载网还被成功应用于解析约1.15 MDa的质体编码RNA聚合酶（分子量较大且提纯产量低），进一步证实了其在实际复杂生物大分子研究中的广泛适用性。
讨论与结论总结
在单颗粒CryoEM中，带有额外支撑膜的多孔载网具有显著优势，包括最小化AWI效应、减少样品吸收到载网材料中以及降低光束诱导运动。本研究提出的基于Vitrobot Mark IV的快速、廉价、简单且一致的GO载网制备方法，使用户能够在投入资源生产更高质量的单层载网之前，以较低成本尝试支撑载网，从而节省时间和资源。
GO载网因其能够缓解常见的样品制备伪影而在CryoEM中日益受到关注。与无支撑的多孔碳或金载网不同，GO提供了一个薄的、亲水的表面，可以将颗粒吸引并固定在远离AWI的地方，从而减少变性和优势取向。虽然已有多种协议用于GO薄膜的功能化或应用，但可重复性和可及性仍是挑战。本研究通过利用商业化的 plunge freezer（ plunge冷冻器）标准化GO应用，弥补了这一空白，为实验室提供了一个无需专用沉积设备即可尝试支撑载网的平台。随着支撑载网在CryoEM研究（尤其是针对脆弱复合物或取向敏感蛋白）中越来越受欢迎，像本研究这样易于采用的方法有助于扩大其使用范围。
评估表明，β-半乳糖苷酶和脱铁蛋白的最终重构分辨率分别为2.33 ?和1.89 ?，这与使用传统无支撑载网获得的结果一致或相当。这证实了在优化颗粒分布时，GO不会损害高分辨率重构的质量。值得注意的是，即使在包含多达五层GO的显微照片中，也能成功拾取和对齐颗粒。这些结果证明，该方法支持高分辨率结构测定，同时改善了颗粒的保存和在载网上的空间分布。
尽管GO载网通常在制造后立即使用，但研究结果表明，它们可以在不进行湿度控制的室温下储存至少21天。在使用前进行短暂的辉光放电可以恢复其亲水性，这使得该方法在日常应用中更加实用。这一发现增强了GO载网在不同通量实验室使用的实用性，因为它减少了每次实验前立即制备载网的需要。然而，不建议制备大批量的GO载网进行长期储存，因为超过测试21天的稳定性仍不确定。
铜和金是CryoEM载网常用的材料，金具有优异的导热性和更强的生物惰性，但成本较高。如前所述，优势取向、AWI降解和样品吸收等挑战会影响这两种类型的载网。这些问题可以通过添加GO支撑层来缓解。研究人员在金网和铜网上测试了该协议，结果表明，使用该方法制备的Quantifoil和UltrAufoil载网的GO覆盖率相当。由于使用聚乙烯亚胺（PEI）作为促进GO粘附的引物，该方法也可应用于市售不常见的载网材料和孔径，为用户提供了更大的载网选择灵活性。
关于GO载网的功能化策略，已有报道包括使用单链DNA、共价修饰和抗体固定。预计用该方法制备的GO载网将与这些功能化策略兼容，实现“载网上纯化”（purification on the grid）并增强颗粒对GO表面的吸附。
在协议优化过程中，研究人员观察到增加GO浓度会提高总体覆盖率，但会降低单层和双层的占比，同时增加粉末衍射（powder diffraction）的出现。同样，偏离本文报告的吸墨时间和力度会导致GO覆盖率欠佳。将辉光放电强度提高到30 mA并不能改善GO分布，这表明更温和的条件可能更有利。然而，更长辉光放电持续时间的影响仍有待探索。
该方法的一个关键优势在于使用Vitrobot Mark IV进行GO应用。Vitrobot可以精细控制环境参数（如温度和湿度）以及可编程的吸墨力度和时间。这种控制水平最大限度地减少了批次间差异，确保了沉积过程的一致性，而这很难通过手动滴铸或表面组装方法实现。通过将GO沉积工作流程适配到大多数CryoEM用户已经熟悉的设备上，该方法降低了实施支撑载网的门槛，并实现了不同用户和实验室之间的可重复制备。
该协议也可以适用于其他 plunge-freezing 系统（如Leica EM GP），这些系统也能像Vitrobot一样维持受控的样品环境。但是，吸墨和干燥参数需要针对每个特定系统进行优化。理想情况下，这种校准也应针对单个Vitrobot单元执行，因为不同机器之间的吸墨力度可能存在显著差异。
虽然该方法提供了灵活性和一致性，但在可扩展性方面存在局限。由于使用Vitrobot Mark IV一次只能处理一个载网，该方法对于大规模载网生产而言较为耗时。一旦确定了用于GO沉积的首选载网材料和孔径，商业采购或替代的大规模生产方法可能会提供更高效的长期解决方案。
结论
研究人员提出了一种利用Vitrobot Mark IV制备GO冷冻电镜载网的简单且可重复的方法。该协议结合了受控环境中的PEI介导的GO粘附，解决了诸如可重复性差和覆盖率不一致等挑战。它能够在铜网和金网上实现高质量的GO沉积，并支持高分辨率结构测定。通过使用标准设备，该方法提高了载网的可及性、样品稳定性和颗粒分布，并可能支持载网上功能化策略。总体而言，它为改进CryoEM样品制备提供了一个实用工具，特别是对于具有挑战性的样品。
