受者来源巨噬细胞通过GSDMD依赖性细胞焦亡（GSDMD-induced pyroptosis）机制介导急性心脏移植排斥反应

《Clinical and Translational Medicine》：Recipient-derived macrophages mediate acute cardiac allograft rejection via GSDMD-induced pyroptosis mechanism

　　

目的：探讨巨噬细胞气道上皮细胞衍生蛋白D（GSDMD）依赖性细胞焦亡（pyroptosis）是否驱动急性心脏移植排斥反应，以及靶向GSDMD是否能改善移植物存活。
方法：通过免疫印迹法评估GSDMD活化情况。在全球性及巨噬细胞特异性GSDMD缺陷受者中分析移植物存活情况。单细胞RNA测序（scRNA-seq）鉴定GSDMD表达细胞群，而免疫细胞浸润和细胞因子则通过流式细胞术和免疫组织化学检测；IL1R1基因敲除和细胞因子刺激用于验证。
结果：GSDMD缺陷显著延长移植物存活时间。单细胞分析显示，在急性排斥反应期间，GSDMD表达和细胞焦亡主要在受者来源的M1巨噬细胞中增加。巨噬细胞特异性GSDMD缺陷减少CD8⁺T细胞/巨噬细胞浸润，并降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-一根β）。TNFα/IL6激活核因子-κB（NF-κB）和Janus激酶-信号转导与转录激活因子3（JAK–STAT3）以上调GSDMD，并且IL-1β被证实为CD8⁺T细胞介导排斥反应的关键效应分子。GSDMD细胞焦亡抑制剂减轻排斥反应并延长移植物存活时间。
结论：受者M1巨噬细胞通过TNFα/IL6驱动的NF-κB/STAT3激活GSDMD介导的细胞焦亡促进急性排斥反应。靶向GSDMD是增强心脏移植物存活的有前景策略。

心脏移植已成为终末期心力衰竭的标准治疗手段，然而缺血-再灌注（I/R）损伤和急性排斥反应仍是威胁移植物存活的不可避免的并发症。移植后，I/R损伤、手术创伤及供者损伤等因素导致移植物内多种形式的细胞死亡，伴随炎症细胞因子的释放。然而，细胞焦亡是否发生于心脏移植物中，以及靶向细胞焦亡能否调控炎症从而影响免疫排斥反应和移植物存活，尚不清楚。细胞焦亡是由气道上皮细胞衍生蛋白（GSDM）家族介导的程序性细胞死亡形式，其特征为caspase切割GSDM蛋白，导致N端片段在细胞膜上形成孔道，引起细胞肿胀、膜破裂及白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）等炎症介质的释放。在GSDM家族中，GSDMD被认为是细胞焦亡的经典介导分子，经典细胞焦亡通路遵循NLRP3-CASPASE1-GSDMD-IL1β顺序。在心脏中，NLRP3抑制剂已被证明可减轻I/R损伤诱导的损伤；在小鼠心脏移植模型中，caspase-1抑制剂治疗显著抑制移植物急性排斥反应并延长移植物存活时间。近期研究表明，GSDMD是改善急性心肌梗死后心室重构和降低心力衰竭的新靶点。其他研究证实，GSDMD突变可保护肾脏免受I/R损伤。移植后心脏移植物中炎症细胞因子包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-1β的上调，表明炎症反应增强。然而，细胞焦亡在这一过程中的确切作用，包括涉及的特定细胞类型及其激活的分子机制，仍知之甚少。该研究旨在探究心脏移植急性排斥期细胞焦亡的发生情况及其在免疫排斥中的作用。

巨噬细胞在炎症反应中发挥核心作用，其中M1巨噬细胞通过分泌TNF-α、IL-1β和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等细胞因子促进炎症。移植急性期M1巨噬细胞尤为重要，它们通过激活内皮细胞和促进T细胞反应显著促进免疫排斥。研究人员开展此项研究，旨在调查心脏移植物急性排斥期间细胞焦亡的发生情况，鉴定涉及的特定细胞类型，阐明驱动GSDMD介导细胞焦亡上调的分子机制，并探索关键炎症因子促进免疫排斥的作用，重点关注IL-1β作为潜在介质的作用。该研究最终为理解细胞焦亡在心脏移植中的作用提供理论依据，并为靶向GSDMD介导的细胞焦亡以减少免疫排斥、降低炎症反应和改善移植物存活提供治疗策略见解。该论文发表于《Clinical and Translational Medicine》。

研究采用的主要关键技术方法包括：利用既往发表的scRNA-seq数据集（GSA数据库：CRA005239）进行单细胞转录组重分析；建立小鼠颈部异位心脏移植模型（BALB/c供心移植至C57BL/6受者）；构建全局性GSDMD基因敲除（GSDMD^-/-）小鼠、IL1R1基因敲除（IL1R1^-/-）小鼠及巨噬细胞特异性GSDMD条件性敲除（GSDMD-CKO，Lyz2^Cre-GSDMD^flox/flox）小鼠；运用流式细胞术进行免疫细胞表型分析和分选；采用免疫组织化学及免疫荧光染色进行蛋白定位和定量；通过蛋白质免疫印迹检测蛋白表达及活化；实施双荧光素酶报告基因检测启动子活性；进行巨噬细胞-CD8⁺T细胞Transwell共培养实验；以及应用GSDMD抑制剂NU6300和双硫仑进行药理学干预。

GSDMD介导的细胞焦亡在小鼠心脏移植急性免疫排斥阶段上调。

研究人员通过重分析既往发表的小鼠心脏移植物单细胞RNA测序数据集（收集于移植后第0、1、3、5天），发现Gsdmd和Il1b在心脏移植物中表达增加，尤其在第5天最为显著。基于小鼠心脏移植模型的进展，将第1-3天定义为晚期I/R阶段，第5天定义为急性免疫排斥阶段。qPCR分析显示，同种异体心脏移植物中Il1b和Gsdmd mRNA水平在第1-3天轻度增加，在第5天显著上调。蛋白质免疫印迹分析证实，第5天同种异体心脏移植物中GSDMD、N-GSDMD和IL-1β蛋白表达显著增加。免疫组织化学染色进一步证实这些发现，显示急性免疫排斥阶段移植物中GSDMD、N-GSDMD和IL-1β表达增强。这些结果表明，GSDMD介导的细胞焦亡在心脏移植物中增强，且在急性免疫排斥阶段最为突出。

GSDMD缺陷减少免疫细胞浸润并延长心脏移植物存活。

为评估GSDMD对心脏移植存活和免疫排斥反应的影响，研究人员在野生型（WT）和GSDMD^-/-小鼠中进行移植实验。与WT受者相比，GSDMD^-/-受者显示心脏移植物存活延长。qPCR分析揭示，GSDMD^-/-受者第5天同种异体移植物中Il1b、Il18、Il6和Tnfα等炎症标志物mRNA水平降低。免疫组织化学染色进一步显示GSDMD^-/-受者同种异体移植物中GSDMD、 however, itzmodetails.含N-GSDMD、IL-1β和TNF-α表达降低，表明炎症反应和细胞焦亡减轻。流式细胞术分析显示，GSDMD^-/-受者第5天同种异体移植物中免疫细胞浸润减少，浸润CD45⁺白细胞、CD8⁺T细胞和巨噬细胞的百分比和绝对数量均降低。研究人员进一步将WT或GSDMD^-/-供心移植至WT受者，发现GSDMD^-/-供心存活时间长于WT供心。免疫荧光染色显示，第5天同种异体WT移植物中CD68⁺巨噬细胞和心肌细胞中GSDMD表达均增加。这些发现共同表明，GSDMD缺陷减轻急性心脏同种异体排斥期间的细胞焦亡相关炎症和免疫细胞浸润。

急性心脏排斥期间M1巨噬细胞增加及其GSDMD介导的细胞焦亡。

为研究心脏移植期间巨噬细胞表型变化，研究人员分析移植后第0、1、3、5天收集的心脏移植物单细胞RNA测序数据。定量分析显示，巨噬细胞比例在第5天显著增加，成为急性排斥阶段的主导细胞群。进一步聚焦巨噬细胞亚群分析，点图分析支持M1样、M2样和驻留巨噬细胞群体的注释。UMAP可视化显示巨噬细胞亚群呼唤移植物中的分布及不同时间点的分布情况。比例分析揭示，第5天M1样巨噬细胞显著增加，伴随排斥进展M2样巨噬细胞相对减少。与第1-3天I/R阶段相比，M1样巨噬细胞在第5天急性排斥阶段急剧增加，占总巨噬细胞的75%以上。特征图显示，M1样炎症基因Nos2在第5天显著增加，同时巨噬细胞中Gsdmd和Il1b表达富集，表明急性排斥期间GSDMD相关细胞焦亡和细胞焦亡相关炎症信号增强。研究人员进一步比较Gsdmd与另一GSDM家族成员Gsdme，发现Gsdme在非心肌细胞中表达相对较低，在巨噬细胞中表达有限，而Gsdmd在巨噬细胞区域富集。在主要移植物细胞群中，巨噬细胞表现出最高的平均Gsdmd表达。进一步在巨噬细胞亚群间比较显示，Gsdmd表达在M1样巨噬细胞中高于M2样和驻留巨噬细胞群体。为验证单细胞发现，研究人员从移植物和脾脏分选巨噬细胞富集细胞进行验证。qPCR显示，同种异体移植物巨噬细胞中Gsdmd、Il1b、Il18和Tnfα mRNA水平增加，尤其在第5天急性排斥阶段。蛋白质免疫印迹进一步确认排斥进展过程中巨噬细胞中GSDMD、N-GSDMD和IL-1β蛋白表达增加。免疫荧光染色显示，第5天同种异体移植物中GSDMD或N-GSDMD与CD86⁺（M1样标志物）细胞的共定位增加。这些发现共同表明，急性心脏同种异体排斥期间伴随M1样巨噬细胞积累和GSDMD相关细胞焦亡增强。

急性心脏排斥期间大多数巨噬细胞来源于移植受者。

为确定心脏移植期间巨噬细胞的来源，研究人员重分析既往发表的单细胞RNA测序数据集并进行供者-受者细胞来源注释。细胞来源分析显示，移植后受者来源细胞逐渐积累，尤其在第3天和第5天。定量分析显示，巨噬细胞占受者来源细胞群的75%以上。每个细胞类型内的细胞来源分析进一步确认，第3天和第5天移植物中大多数巨噬细胞来源于受者。为实验验证这一发现，研究人员将BALB/c供心移植至CAG-EGFP受者小鼠，第5天收集移植物进行流式细胞术和免疫荧光分析。流式细胞术鉴定CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺细胞中GFP⁺巨噬细胞，代表性结果显示第5天GFP⁺细胞占移植物浸润巨噬细胞的91.7%。定量分析进一步确认超过90%的移植物浸润巨噬细胞为GFP⁺受者来源细胞。免疫荧光染色显示第5天同种异体移植物中GFP和CD68广泛共定位，GFP⁺CD68⁺细胞占CD68⁺细胞总数的90%以上。这些发现表明，急性心脏排斥期间浸润移植物的巨噬细胞大多数来源于受者。

受者来源GSDMD缺陷巨噬细胞可延长心脏移植物存活。

为确定受者来源巨噬细胞GSDMD是否促进急性心脏同种异体排斥反应，研究人员利用Lyz2-Cre系统构建巨噬细胞特异性GSDMD缺陷小鼠。移植前检查排除基线免疫差异，发现GSDMD-WT和GSDMD-CKO小鼠在CD8⁺T细胞或F4/80⁺巨噬细胞浸润、脾脏巨噬细胞比例、TNF-α⁺和IL-1β⁺巨噬细胞比例等方面无显著差异。随后将BALB/c供心移植至GSDMD-WT或GSDMD-CKO受者，与GSDMD-WT受者相比，GSDMD-CKO受者显示心脏移植物存活显著延长。第5天移植物流式细胞术分析进一步显示GSDMD-CKO受者免疫细胞浸润减少，CD45⁺白细胞、CD8⁺T细胞和巨噬细胞的百分比和绝对数量降低。此外，GSDMD-CKO移植物中TNF-α⁺和IL-1β⁺巨噬细胞的比例和绝对数量均减少，表明巨噬细胞炎症活化减弱。免疫组织化学染色显示GSDMD-CKO移植物中CD45、CD8、F4/80、TNF-α、IFN-γ和IL-1β表达降低。研究人员进一步分析第5天移植物中巨噬细胞极化，发现GSDMD-CKO移植物中CD86⁺ M1样巨噬细胞减少，CD206⁺ M2样巨噬细胞增多。这些数据表明，巨噬细胞特异性GSDMD缺陷抑制促炎M1样极化，促进向抗炎M2样表型转变。这些发现共同表明，受者来源巨噬细胞GSDMD促进移植物炎症和排斥反应，而巨噬细胞特异性GSDMD缺陷通过减少免疫细胞浸润、炎症细胞因子产生和M1样巨噬细胞极化延长心脏移植物存活。

GSDMD缺陷巨噬细胞通过IL-1β减弱CD8⁺T细胞募集和活化。

为确定受者来源巨噬细胞是否调节急性排斥期间CD8⁺T细胞募集和活化，研究人员进行巨噬细胞-CD8⁺T细胞Transwell共培养实验。将BALB/c供心移植至GSDMD-WT或GSDMD-CKO受者小鼠，术后第5天从心脏移植物和脾脏分离CD68⁺巨噬细胞富集细胞。从WT C57BL/6脾脏分离CD8⁺T细胞，用抗CD3/CD28激活后进行共培养。与对照组相比，WT第5天巨噬细胞显著增加下室迁移CD8⁺T细胞数量，而GSDMD-CKO巨噬细胞募集CD8⁺T细胞能力降低。WT巨噬细胞组IL-1β中和也减少CD8⁺T细胞迁移，而GSDMD-CKO巨噬细胞组重组IL-1β补充恢复CD8⁺T细胞募集。一致地，WT巨噬细胞增加TNF-α⁺CD8⁺T细胞数量，而GSDMD缺陷或IL-1β中和减弱此效应，重组IL-1β补充恢复该效应。这些发现表明，受者来源巨噬细胞在急性排斥期间促进CD8⁺T细胞募集和功能活化，至少部分通过GSDMD-IL-1β依赖性机制。

TNF-α/IL-6通过NF-κB/STAT3在急性排斥期间诱导巨噬细胞GSDMD上调。

为探究急性排斥期间巨噬细胞GSDMD上调的分子机制，研究人员比较第1天和第5天移植物浸润巨噬细胞的转录组特征。差异表达分析显示第5天巨噬细胞中炎症和干扰素相关基因显著上调，包括Gsdmd、Il1b、Casp1、Stat3、Irf1和Cxcl10。通路富集分析揭示干扰素反应（II型干扰素：IFN-γ和I型干扰素：IFN-α）、同种异体排斥反应、TNF-α/NF-κB信号和IL-6/JAK/STAT3信号等炎症通路激活。GO分析进一步显示细胞因子和干扰素反应通路富集，提示炎症细胞因子信号可能促进急性排斥期间巨噬细胞GSDMD激活。为验证这一可能性，研究人员用TNF-α或IL-6体外刺激RAW264.7巨噬细胞。qPCR分析显示 TNF-α and iL-6 increased 增加Stat3、Nfkb、Gsdmd、Il1b、Ifna和Ifng表达，呈浓度依赖性。蛋白质免疫印迹进一步确认TNF-α和IL-6增强STAT3和NF-κB活化，表现为p-STAT3和p-NF-κB水平增加，伴随GSDMD、N-GSDMD、IFN-α和IFN-γ表达增加。体内实验中，NF-κB抑制剂BAY 11-7082或STAT3抑制剂Stattic处理降低第5天同种异体移植物中Gsdmd、Il1b、Ifna和Ifng表达。双荧光素酶报告基因检测显示STAT3和NF-κB增强GSDMD启动子活性，增加STAT3或NF-κB质粒浓度进一步以剂量依赖性方式增加启动子活性。这些发现表明，TNF-α/IL-6相关NF-κB/STAT3信号促进急性心脏同种异体排斥期间巨噬细胞GSDMD上调。

IL-1β可逆转巨噬细胞GSDMD缺陷介导的心脏移植物存活延长。

鉴于GSDMD介导的巨噬细胞焦亡促进心脏移植期间IL-1β产生，研究人员进一步检测IL-1β信号在急性心脏同种异体排斥中的作用。PCR基因分型确认Il1r1^-/-小鼠的成功鉴定。研究人员首先将Il1r1^-/-小鼠作为供者或受者用于心脏移植模型。与WT同种异体移植相比，Il1r1^-/-供心移植物和移植至Il1r1^-/-受者的移植物均显示存活延长，提示IL-1信号中断减轻移植物排斥。为确定IL-1β是否介导巨噬细胞特异性GSDMD缺陷的保护作用，向GSDMD-CKO受者腹腔注射重组小鼠IL-1β（100 μg/kg，移植后隔日一次）。IL-1β补充缩短GSDMD-CKO受者移植物存活时间，从而部分逆转巨噬细胞特异性GSDMD缺陷带来的存活益处。免疫组织化学染色显示GSDMD-CKO移植物中CD8⁺T细胞和F4/80⁺巨噬细胞浸润减少，而IL-1β补充恢复移植物中免疫细胞浸润。流式细胞术分析进一步确认IL-1β处理增加GSpatial reasoning about the effects on immune cell infiltration by calculating from the context that continuing education should maintain前车之覆GSDMD-CKO移植物中浸润CD45⁺白细胞、CD8⁺T细胞和巨噬细胞的比例。为研究IL-1β恢复巨噬细胞炎症细胞因子谱，研究人员进一步分析细胞因子阳性巨噬细胞群。GSDMD-CKO移植物中TNF-α⁺和IFN-γ⁺巨噬细胞比例低于GSDMD-WT移植物，而重组IL-1β处理增加GSDMD-CKO移植物中这些细胞因子阳性巨噬细胞群。然而，重组IL-1β处理后IL-1β⁺巨噬细胞比例仍保持较低水平，提示外源性IL-1β主要恢复下游巨噬细胞炎症活化而非内源性IL-1β产生。这些发现共同表明，IL-1β是巨噬细胞GSDMD依赖性炎症的重要下游介质，促进免疫细胞浸润和加速心脏同种异体排斥。

GSDMD抑制剂可减少免疫细胞浸润并促进移植物存活。

为评估药理学抑制GSDMD是否能减轻急性心脏同种异体排斥，研究人员对WT受者移植后给予GSDMD抑制剂NU6300或双硫仑处理。与溶媒处理组相比，NU6300和双硫仑处理均显著延长心脏移植物存活。第5天移植物蛋白质免疫印迹分析显示，NU6300处理显著降低N-GSDMD表达，而总GSDMD表达无显著变化。类似地，双硫仑处理降低第5天移植物中N-GSDMD水平，而不显著影响总GSDMD表达。此外，剂量反应分析显示，增加NU6300或双硫仑剂量逐渐降低同种异体第5天移植物中GSDMD切割和N-GSDMD表达，支持有效抑制GSDMD介导的细胞焦亡。研究人员进一步检测GSDMD抑制是否影响移植物浸润免疫细胞。流式细胞术分析显示，与溶媒处理相比，NU6300处理减少第5天同种异体移植物中CD45⁺白细胞和CD8⁺T细胞的百分比。一致地，双硫仑处理也降低第5天移植物中CD45⁺白细胞和CD8⁺T细胞浸润。这些发现表明，药理学抑制GSDMD减少GSDMD切割、减轻免疫细胞浸润，并在急性排斥期间延长心脏移植物存活。

研究人员在讨论部分指出，其既往研究描述了心脏同种异体移植物急性细胞排斥期间细胞焦亡的景观，发现GSDMD介导的细胞焦亡在急性排斥阶段显著升高。在此基础上，研究进一步探索GSDMD介导的细胞焦亡在心脏移植中的免疫学作用。scRNA-seq分析显示，巨噬细胞在急性排斥期间发生从M2到M1表型的转变，M1巨噬细胞中GSDMD表达显著增加。因此，靶向巨噬细胞GSDMD可能是延长移植物存活的潜在治疗策略。其潜在机制可能涉及巨噬细胞从受者循环趋化至移植物，被炎症因子（如TNF-α和IL-6）激活后上调GSDMD表达，为细胞焦亡活化提供必需蛋白。巨噬细胞焦亡促进炎症细胞因子IL-1β释放，进一步加剧其他炎症介质水平，触发炎症风暴。靶向GSDMD可有效阻断这一过程，减少免疫细胞浸润和炎症细胞因子水平，从而延长移植物存活。

研究人员总结认为，该研究阐明了心脏巨噬细胞在移植中的功能以及GSDMD介导细胞焦亡的影响。这些发现增进了对心脏及其他器官移植中免疫反应的理解，为改善移植预后提供了新的理论和 therapeutic avenues。具体而言，研究人员得出以下结论：受者M1巨噬细胞通过TNFα/IL6驱动的NF-κB/STAT3激活GSDMD介导的细胞焦亡促进急性排斥反应；靶向GSDMD是增强心脏移植物存活的有前景策略。这一结论基于全球性和巨噬细胞特异性GSDMD缺陷小鼠、IL-1β挽救实验以及巨噬细胞-CD8⁺T细胞共培养实验的结果，支持GSDMD介导的巨噬细胞焦亡在急性心脏同种异体排斥中的作用。