CD98hc靶向的抗体穿梭体用于中枢神经系统递送，具有广泛的跨物种反应性

《Nature Biomedical Engineering》：CD98hc-targeted antibody shuttles for central nervous system delivery with broad cross-species reactivity

　　

靶向血脑屏障（BBB）并介导转运至脑实质的双特异性抗体正被用于增强IgGs及其他生物制剂的治疗潜力。然而，针对人类BBB靶点（如CD98hc或转铁蛋白受体1（TfR1））的特异性抗体通常要么不与临床前测试常用物种（如小鼠或食蟹猴（cyno））的同源物发生交叉反应，要么存在较大的亲和力差异。为此，研究人员采用主动学习方法分离出具有广泛物种交叉反应性的抗CD98hc抗体，从而解决了上述两个限制。该研究从一株完全人源化抗体出发，该抗体能结合人类和食蟹猴CD98hc，但不结合小鼠CD98hc；通过迭代诱变和文库优化逐步进化，最终获得一系列抗体，这些抗体能够以相似的亲和力识别小鼠、食蟹猴和人类CD98hc，具有相似的表位，并表现出高效且持久的脑部递送能力。研究人员预计，这些CD98hc靶向的中枢神经系统（CNS）穿梭体将消除对转基因动物或替代抗体的需求，从而加速临床转化。

**论文解读：CD98hc靶向抗体穿梭体实现中枢神经系统递送与广泛跨物种反应性**

**研究背景与问题**
单克隆抗体及其他生物制剂在治疗中枢神经系统（CNS）疾病时，因血脑屏障（BBB）的存在而递送效率低下。双特异性抗体（穿梭体）通过靶向脑内皮细胞受体（如转铁蛋白受体1（TfR1）或CD98hc）介导跨细胞转运，成为增强CNS递送的重要策略。然而，针对CD98hc的穿梭体面临两大障碍：一是缺乏跨物种反应性，多数抗人CD98hc抗体不结合小鼠同源物，导致临床前测试需依赖转基因动物或替代抗体；二是不同物种间亲和力差异大（如人/食蟹猴间差异>5倍），影响药代动力学（PK）和药效学（PD）外推。为克服这些瓶颈，研究人员旨在开发具有广泛跨物种反应性（识别小鼠、食蟹猴和人类）的抗CD98hc抗体，以加速临床转化。该研究发表于《Nature Biomedical Engineering》。

**主要研究内容与结论**
研究人员采用主动学习方法，从一株仅结合人/食蟹猴CD98hc但不结合小鼠CD98hc的完全人源化抗体（WT）出发，通过迭代诱变和文库优化，逐步进化出一系列抗体，这些抗体以相似亲和力（平衡解离常数KD约10–60 nM）识别三种物种CD98hc，具有相似表位，并在体内实现高效、持久的脑部递送。将抗体改造成双特异性IgG-scFv格式后，在野生型小鼠和人类化CD98hc小鼠中均表现出与已知穿梭体相当的脑摄取和滞留能力，且消除了对转基因动物的需求，有望加速临床转化。

**关键技术与方法（不超过250字）**
1. **组氨酸扫描诱变**：鉴定HCDR3中允许突变的位点（10/16个残基）。
2. **软随机诱变与酵母表面展示**：构建第一代HCDR3文库（理论多样性~10¹³），通过荧光激活细胞分选（FACS）富集同时结合人/小鼠CD98hc的变体。
3. **深度测序与PSERM评分**：利用位置特异性富集比矩阵（PSERM）指导第二代HCDR3文库设计，缩小多样性至~10⁵，实现可筛选性。
4. **平行亲和力成熟文库**：分别对HCDR1/HCDR2和LCDR1/LCDR3进行软随机诱变，随后通过CDR改组（shuffling）合并文库，最终筛选出5个跨物种反应性抗体。
5. **双特异性抗体构建**：将单链抗体（scFv）融合至含knobs-into-holes突变的IgG重链C端，在HEK293-6E细胞中表达，经Protein A纯化。

**研究结果**
**1. Active learning enables directed evolution of species-cross-reactive antibodies targeting CD98hc**
- 通过组氨酸扫描鉴定HCDR3中10个允许突变位点，构建软随机文库。
- 经FACS分选（结合人/小鼠CD98hc）和深度测序，PSERM评分（AUC=0.96）优于其他指标（如PSSM、富集比），用于指导第二代HCDR3文库设计。
- 结合HCDR1/HCDR2和LCDR1/LCDR3文库，通过CDR改组获得5个抗体（D4-4、3.5D19、3.5D5、D4-9、ADN2-14），对小鼠、食蟹猴和人类CD98hc的KD值接近（10–60 nM），且差异<2–3倍。
- 这些抗体具有良好的人源性（0.91–0.93）和低T细胞表位预测（4–8个），与临床阶段抗体相当。

**2. Bispecific antibodies targeting CD98hc possess favourable in vitro and in vivo properties**
- 双特异性抗体在纯化后单体含量>90%，热稳定性（Tm）>65°C，自我聚集水平低。
- **表位分析**：抗体通过结合CD98hc的loop1（377-ALPGQPME-384）和loop2（391-DESSFPDIP-399）实现跨物种识别；关键残基在人和小鼠中不同，如人CD98hc loop1的Gln-381与小鼠的Leu-372。
- **功能互补位分析**：D4-4中HCDR3的12个残基（如Tyr-96、Trp-97）和HCDR2的Leu-50对结合小鼠CD98hc至关重要，而人类CD98hc仅依赖3个HCDR3位点。
- **体内药代动力学**：在野生型小鼠中，3.6 mg kg^?1剂量下，1天脑浓度达3.1–3.6 nM，1周后仍为1.8–2.7 nM，脑血比提升31–144倍；高剂量（10.8 mg kg^?1）下IgG/3.5D5脑浓度最高（6.9 nM，1天）。
- 在人类化CD98hc小鼠中，D4-4穿梭体与TV6.8（人/食蟹猴特异性）的脑摄取和滞留模式相似，脑浓度和血浓度均接近。

**讨论与结论**
讨论指出，这些抗体是罕见的能同时识别小鼠、食蟹猴和人类CD98hc的分子，克服了此前抗体缺乏跨物种反应性和亲和力不均的问题。表位分析显示抗体结合两个保守性低的loop，但通过主动学习成功实现。该方法具有通用性，可扩展至其他BBB靶点（如TfR1）。研究局限性在于缺乏高分辨率复合物结构以阐明机制。结论翻译如下：
“更广泛地，本研究报告的工程化双特异性抗体为人类疾病小鼠模型的众多未来临床前研究打开了大门，消除了对人类化CD98hc小鼠的需求，这具有重要意义，因为它克服了若干实际和知识产权问题，从而加速了临床转化。”