进化上保守的短线性基序驱动肌动蛋白丝结合

《Nature Cell Biology》：Evolutionarily conserved short linear motifs drive actin filament binding

　　

肌动蛋白结合蛋白（ABP）对肌动蛋白细胞骨架的调控对于细胞稳态至关重要，而肌动蛋白结合模式决定了ABP的活性。研究人员基于三磷酸肌醇3-激酶A（ITPKA）-肌动蛋白丝复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构，鉴定出一种"短线性肌动蛋白丝结合基序"（SFM）。利用计算流程SLiMFold，研究人员发现103种含SFM的人类蛋白质，这些蛋白具有多样的细胞功能。系统发育分析表明，SFM是自发产生（de novo）并在真核生物中保守，其肌动蛋白丝结合亲和力为2-12 μM。研究人员明确了介导结合和调节亲和力的关键残基，并解析了两个SFM-肌动蛋白丝复合物的冷冻电镜结构，揭示了SFM结合可降低肌动蛋白丝的刚度。这些发现表明SFM调控肌动蛋白丝构象，并作为锚定模块将肌动蛋白动力学与广泛的细胞功能相连接，为理解众多蛋白的肌动蛋白相关作用提供了框架。

肌动蛋白丝是真核细胞中动态的细胞骨架框架，驱动细胞运动、分裂和形态发生等关键过程。这些过程由不同的肌动蛋白结合蛋白（ABP）以及信号和支架蛋白协同调控。ABP参与肌动蛋白丝的聚合、成核、封端、切割、交联和成束，并协调肌动蛋白周转。它们对肌动蛋白动力学的影响取决于肌动蛋白结合结构域（ABD）的亲和力，且在大多数情况下还依赖于细胞刺激。部分ABP在静息细胞中处于非活性状态，许多被小GTP酶激活。ABP调控或表达异常以及突变均可导致严重疾病，如神经和免疫疾病以及癌症。

尽管已有大量保守结构域和基序被鉴定，并据此定义了功能相似的ABP家族，但许多ABP仍存在未表征的肌动蛋白丝结合结构域，人类三磷酸肌醇3-激酶A（ITPKA）即为一例。ITPKA组成性结合肌动蛋白丝，并通过同源二聚体形成表现出肌动蛋白丝成束活性。ITPKA参与调节海马神经元突触后肌动蛋白架构，也在恶性肿瘤细胞中表达，其肌动蛋白成束活性诱导细胞突起形成，这对肿瘤侵袭至关重要。

为解析ITPKA结合肌动蛋白丝的分子基础，研究人员解析了ITPKA-肌动蛋白丝复合物的冷冻电镜结构，分辨率达2.97 ?。结构中ITPKA的ABD清晰可见，而催化结构域及其与ABD的连接区域未解析到，证实C端InsP₃激酶结构域不直接参与肌动蛋白丝结合。氨基酸残基Arg28-Ala49结合于亚结构域（SD）1和3之间的疏水槽，同时接触相邻肌动蛋白亚基（A_-2）的DNase结合环（D-loop）。

研究人员发现ITPKA的核心ABD仅由21个氨基酸残基折叠成α-螺旋，具有短线性基序（SLiM）特征，且结构与肌动蛋白丝探针Lifeact相似。基于这一发现，研究人员将ITPKA_Arg28-Ala49与Lifeact进行结构比对，发现高度相似的螺旋定位，包括对齐的位置Val（P1）、Leu（P4）、Phe（P8）和Glu（P9）。由此提出肌动蛋白丝结合SLiM的共有序列VxxLxxxFE。

为探究其他人类蛋白是否含有该基序，研究人员开发了计算流程SLiMFold，整合多种生物信息学工具进行候选基序的鉴定、过滤和结构预测。首先，从ITPKA_Arg28-Ala49和Lifeact的比对序列获得位置特异性打分矩阵（PSSM），用于筛选NCBI人类蛋白数据库。PSSM对每个基序位置打分，不仅接受精确匹配，也接受相近氨基酸（如Val、Leu和Ile或Phe和Tyr）的兼容替换。随后应用PSIPRED、ANCHOR和IUPred阈值进一步过滤候选。对每个命中序列，使用jackhmmer进行多序列比对（MSA），再输入ColabFold进行结构预测。模型用预测局部距离差异测试（pLDDT）、预测模板建模分数（pTM）和界面pTM分数（ipTM）评估，ipTM均值<0.6的候选被排除。通过测量均方根偏差（RMSD）、螺旋取向（Δθ, Δφ）和螺旋极性，与参考ITPKA_Arg28-Ala49进行比较，再用hdbscan算法聚类。Cluster 3相对于ITPKA显示出最小的RMSD和取向偏移，表明高度相似的肌动蛋白结合螺旋排列。59个聚类命中的序列logo证实了P1、P4、P8和P9位置的强保守性，最高保守度位于P1和P8。该基序被命名为短线性肌动蛋白丝结合基序（SFM）。

研究人员随机选择候选进行分组验证。第一组包括PH结构域蛋白1和4（FGD1和FGD4）、DENN结构域蛋白1（DENNDC1）、Rho鸟苷酸交换因子11（ARHGEF11）和DIX结构域蛋白1（DIXDC1），通过在原代人类巨噬细胞和H1299细胞中表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）标记肽段或全长蛋白，进行肌动蛋白丝共定位验证。第二组包括成束蛋白Shroom家族成员3（SHROOM3）、Espin样蛋白（ESPNL）、泛素特异性肽酶54（USP54）、心脏富集FHL2互作蛋白（CEFIP）和紧密连接蛋白Cingulin样1（CGNL1），通过重组肽段的肌动蛋白丝共沉淀实验验证。

第一组SFM肽段与阳性对照Lifeact、ITPKA_Arg28-Ala49一样，在原代人类巨噬细胞中短暂表达为EGFP融合肽段。特异性突变体（P1位Val→Ala和P8位Phe→Ala；Val→Glu和Phe→Glu）被用于测试。结果显示，Lifeact、ITPKA_Arg28-Ala49、FGD4和ARHGEF11与足体核心显著共定位，而DENND1C主要定位于足体帽，FGD1显示更分散的分布，部分与足体重叠。所有P1和P8突变体均呈弥散分布，证实这些位置对肌动蛋白丝结合至关重要。全长蛋白的野生型（WT）与肌动蛋白丝共定位，P1/P8突变后完全消失，突出SFM在全长蛋白中介导肌动蛋白丝结合的关键作用。

第二组候选通过共沉淀实验评估亲和力。阳性对照Lifeact和ITPKA以约2 μM的K_d,app结合肌动蛋白丝，而新鉴定肽段的亲和力较弱，K_d,app为6-12 μM。通过计算Gibbs自由能变化（ΔG）和差异自由能（ΔΔG），发现ITPKA/Lifeact与USP54、ESPNL、CEFIP、SHROOM3和CGNL1组之间存在中度但明显的差异。

为识别调节亲和力的氨基酸，研究人员基于ITPKA、CEFIP、USP54、FGD4、ARHGEF11、DIXDC1和Lifeact的MSA生成位置特异性频率矩阵（PSFM）。定义了三个热点区域：N端、内部（P1和P9之间）和C端基序。在SHROOM3和USP54中.includesize.swtuation targeted mutations revealed that substitutions between conserved P1 and P9 significantly enhanced actin filament binding—fourfold for SHROOM3 M3 and threefold for USP54 M3. However, mutations N- or C-terminal to P1 and P9 had no significant effects. The K_d,app of USP54 M1 (1.7 ± 0.2 μM) and SHROOM3 M1 (3.9 ± 0.39 μM) were significantly lower than their WT counterparts, with corresponding ΔΔG indicating moderate differences. These data suggest that amino acids between conserved P1 and P9 modulate SFM peptide binding affinity.

研究人员解析了USP54 M1-肌动蛋白复合物的冷冻电镜结构。突变体螺旋以与ITPKA和Lifeact相同的取向和极性结合于经典SFM口袋。保守位点P1、P4、P8和P9采取相似构象，并与相同的肌动蛋白氨基酸相互作用（ITPKA和USP54 M1的Cα RMSD为1.30 ?）。螺旋轮投影显示，USP54 M1中引入的P9位谷氨酸与肌动蛋白残基Ser350和Leu349相互作用，而P5位Ile仅与肌动蛋白内的一个氨基酸Ile345相互作用。这些发现表明Gln→Glu突变是USP54 M1增强肌动蛋白结合强度的主要原因。结构和生化分析共同表明，保守位点P4和P9在调节SFM肽段对肌动蛋白丝的亲和力方面起关键作用。

为探究SFM结合是否引起机械效应，研究人员进行了全原子分子动力学（MD）模拟。单独肌动蛋白丝的持久长度（L_p）为9.4 ± 1.2 μm，而ITPKA或USP54 M1装饰后L_p显著降低：ITPKA装饰丝为6.3 ± 0.7 μm，USP54 M1装饰丝为5.1 ± 0.8 μm。SFM结合意外地导致肌动蛋白D-loop的刚性化。未装饰肌动蛋白的D-loop具有高度柔性，USP54装饰适度降低其柔性，ITPKA存在时进一步限制，导致显著刚性化。ITPKA介导的显著效应可能通过形成与D-loop及SD1的残基80-100的额外接触实现。研究人员进一步研究了SFM对丝内横向肌动蛋白-肌动蛋白相互作用的影响。SFM结合直接接触的残基在沿长螺距螺旋的亚基间接触中表现出最大的局部变化，与SFM结合"隔离"界面原子、阻止其介导亚基间相互作用的机制一致。例如，两种肽段均导致Gln49-Glu167间亚基接触的总体占有率降低（ITPKA降低22%，USP54 M1降低26%）。超出这些局部D-loop接触重组，两种肽段还诱导远离SFM结合位点的肌动蛋白-肌动蛋白接触发生显著变化，提示存在变构效应。具体而言，观察到Ile64-Ile289、Ile64-Leu171和Thr202-Asp286等亚基间接触强烈减少，同时Met47-Thr148等接触增加。这些协调的增减表明丝界面关键边缘的负载承载横向接触发生重新分配，而非结合位点简单的净接触损失。这些SFM驱动的变化表明肽段结合重塑了横向肌动蛋白-肌动蛋白偶联，降低了有效链间连接性，为观察到的L_p降低和丝弯曲柔性增加提供了机制解释。

为深入理解基序的进化发展，研究人员构建了追溯每个验证SFM蛋白至其最近共同祖先（MRCA）的系统发育树。分析揭示SHROOM3的SFM最早出现在双侧对称动物，随后是DIXDC1、USP54和CGNL1的SFM出现在脊椎动物中。CEFIP、DENNDC1、ESPNL、FGD1和FGD4的SFM出现在有颌类，而ARHGEF11和ITPKA的基序出现在真骨类。在刺胞动物、软体动物和线虫等其他动物门中的搜索未发现基序阳性直系同源物，表明SFM在动物进化中相对较晚出现。早期MRCA并不意味着在后代谱系中普遍保留，高阶分类群中的片段化分布与谱系特异性丢失或分歧一致。保守基序编码外显子或模块的缺失、直系同源物中片段化的分类学分布以及基序年龄小于基因年龄，均表明SFM的趋同进化及其自发（ex nihilo）起源。类群汇总的序列logo一致突出Val（P1）、Leu（P4）、Phe（P8）和Glu（P9）为跨分类群的主要保守残基。非 synonymous-to-synonymous突变比率（dN/dS）<1证实了纯化选择，表明SFM核心受到强大的进化约束以保持功能性肌动蛋白丝结合能力。

研究人员通过纳入已鉴定SFM肽段精炼PSSM，再进行两轮迭代，编制了最终的人类SFM蛋白列表。共获得124个最终SFM序列，分布于103个基因中。其中26种蛋白已通过基于截断的方法测试验证，16种蛋白通过更间接的方法已知结合肌动蛋白丝。功能分类显示，最大类群为直接调节肌动蛋白的蛋白，包括皮质肌动蛋白（CTTN）、钙调蛋白结合蛋白（CALD1）和超绒毛蛋白（SVIL）等；其次为调节肌动蛋白调节蛋白活性的蛋白，包括Ras同源物家族成员（Rho）GTP酶激活剂和沉默子以及ROCK和Slingshot磷酸酶（SSH2和SSH3）等；还有许多微管结合蛋白、相当数量的衔接或支架蛋白，以及较少的连接相关蛋白和染色质相关蛋白。

研究人员发现的核心SFM序列V_(P1)xxL_(P4)xxxF_(P8)E_(P9)折叠成仅九个氨基酸的单α-螺旋，侧翼为非保守残基。P1位Val和/或P8位Phe在肌动蛋白丝结合中的关键作用在巨噬细胞和H1299细胞中得到证实。P4位Leu和P9位Glu对结合的关键性较低，但对亲和力调节至关重要。SHROOM3的P4位Lys和USP54的P9位Gln导致相对较低的亲和力，而相应突变显著增强结合。这些发现表明P4和P9位氨基酸主要调节SFM肽段对肌动蛋白丝的结合强度。然而，亲和力调节并非仅由P4和P9控制，ESPNL尽管在这些位置含有保守的Leu和/或Glu，仍表现出相对较低的K_d,app为6 μM，提示额外螺旋等因素也可能影响亲和力。

直接相互作用可能受磷酸化调节，NetPhos分析显示SFM的N端边缘（P_-2-P₀）富集Ser/Thr磷酸化位点。在USP54 M1结构中，Ser7（P₀）与肌动蛋白Asp25形成氢键，提示该位点磷酸化可能通过静电作用减弱或消除相互作用，精细调控SFM-肌动蛋白结合。

与WH2基序的比较表明，两者虽同属SLiM家族且结合SD1和SD3之间的疏水槽，但WH2主要与单体肌动蛋白相互作用，采用与ITPKA相反的极性取向，其N端接近D-loop，不利于丝装饰。相比之下，SFM利用保守锚点（P1、P4、P8和P9）的几何构型避免了D-loop冲突，支持丝结合。因此，SFM和WH2构成了不同的肌动蛋白结合方案，分别特化为丝状和单体肌动蛋白。

SFM与多种保守球状肌动蛋白结合结构域存在关联。Vinculin和α-catenin的ABD由短α-螺旋排列成紧凑束，其螺旋4介导与肌动蛋白SD1的疏水相互作用，涉及与SFM保守氨基酸相互作用的Ile345和Ile341。L-plastin的CH3-CH4结构域通过疏水和极性接触结合SD1，与ITPKA-SFM复合物在肌动蛋白SD1上相互作用的残基相同。Cofilin-1也与Ile341、Ile345和Leu349相互作用，其螺旋在疏水槽内的取向与SFM肽段相同，重叠的结合位点可能解释Lifeact与cofilin-1竞争结合肌动蛋白丝的现象。重要的是，cofilin-1和ITPKA均使肌动蛋白丝软化：cofilin-1的L_p降低约4.4倍，主要通过诱导SD2的D-loop构象变化促进丝切割；而ITPKA和USP54 M1仅降低约1.5-1.8倍。ITPKA较长的SFM与D-loop残基的更广泛相互作用可能导致更明显的D-loop刚性化。

SLiMFold预测表明，小SFM螺旋存在于103种高度多样的蛋白中，其中26种SFM的肌动蛋白结合已通过实验验证。功能分类涵盖直接调节肌动蛋白的蛋白、调控肌动蛋白调节蛋白活性的蛋白、微管结合蛋白、衔接或支架蛋白以及染色质重塑蛋白。在肌动蛋白调节相关蛋白中，皮质肌动蛋白（CTTN）除cortactin重复外，相邻包含SFM的连接区也介导高亲和力肌动蛋白丝结合，这对维持细胞突起可能很重要。钙调蛋白（CALD1）的SFM可被钙调蛋白置换，表明SFM介导的肌动蛋白结合在细胞刺激后减弱。ARHGEF11中SFM缺失破坏Rac和Rho信号平衡，损害A431癌细胞前缘突起和尾缘回缩的形成。ITPKA仅含单个SFM，但其缺失严重破坏肌动蛋白架构并损害肺癌细胞侵袭，表明SFM无需重复聚集即可介导肌动蛋白丝靶向。ITPKA的SFM还参与信号转导调控，其缺失显著降低InsP₃激酶活性，改变海马神经元和癌细胞中的钙信号。癌症相关衔接蛋白PEAK通过SFM靶向肌动蛋白并招募paxillin至黏着斑，paxillin本身也含SFM并招募vinculin和actopaxin。紧密连接蛋白ZO-1的SFM缺失改变肾MDCK细胞的屏障功能。

对于微管相关蛋白，SFM介导的肌动蛋白丝靶向可能为肌动蛋白和微管细胞骨架之间提供物理连接。在染色质相关蛋白中，SFM介导的肌动蛋白靶向可能起支架作用。

两个核心问题尚待未来研究：SFM是否提供广泛的细胞网络？还是定义了进化过程中为适应环境变化而精修的局部分子回路？鉴于SFM可能ex nihilo产生，后一假设更为合理。最终，SFM介导的肌动蛋白丝靶向调节多种细胞蛋白的特性，未来研究可能揭示更多迄今未识别的生物学功能。将基序搜索扩展至非人类数据库，有望揭示SFM在不同物种间的保守性和功能多样性，提供更深层次的进化见解并可能鉴定新的SFM蛋白。研究人员预期SFM蛋白生物学作用的阐明将揭示生理和病理背景下的细胞调控机制。

该研究发表于《Nature Cell Biology》。主要关键技术方法包括：冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒螺旋重构；基于AlphaFold2 Multimer的ColabFold结构预测流程；计算流程SLiMFold整合PSSM评分、PSIPRED二级结构预测、IUPred内在无序区预测、ANCHOR结合位点预测、jackhmmer序列搜索和hdbscan聚类；原代人类巨噬细胞和H1299细胞系中的细胞转染与共定位分析；肌动蛋白丝共沉淀与表观解离常数（K_d,app）测定；全原子分子动力学（MD）模拟及持久长度（L_p）计算；多序列比对和位点特异性频率矩阵（PSFM）分析；系统发育树构建与非同义/imer synonymous突变比率（dN/dS）分析。