基于氨基酸序列的人源蛋白亚细胞定位预测器(sequence-based subcellular localization predictors)的综合基准评测(benchmark)

《Nature Methods》：A comprehensive benchmark of sequence-based subcellular localization predictors for human proteins

　　

基于序列的计算性蛋白亚细胞定位(subcellular localization)预测器有潜力加速蛋白功能与相互作用的发现，从而推进对人生物学及疾病的理解。尽管已有众多方法被提出，但现有评测受限于小型测试集、粗粒度细胞区室(compartments)标签及单标签分类(single-label classification)，而事实上近半数人源蛋白定位于多个区室。本研究整合主要蛋白数据库注释，构建了含3,814个人源蛋白、经高度验证且规模两倍于前的基准测试集。利用该数据集，研究人员系统性评测了现有基于序列的预测器，并比较了蛋白质语言模型(protein language models, PLMs)与不同聚合(aggregation)策略的组合。研究发现当前模型在细粒度(fine-grained)区室、多定位(multilocalizing)蛋白及已知致错误定位的致病性变异(pathogenic variants)上表现欠佳。结果揭示了现有方法的根本局限性，强调需改进模型、标准化基准数据集及更严格评测亚细胞定位预测。

论文解读：《A comprehensive benchmark of sequence-based subcellular localization predictors for human proteins》发表于《Nature Methods》

一、研究背景与开展原因

真核细胞通过膜、无膜凝聚体及细胞器实现区室化(compartmentalization)，各亚细胞区室维持特异生化环境以执行特定功能（如线粒体行能量代谢、溶酶体行降解、核仁行核糖体生物合成、细胞核行DNA调控）。蛋白既塑造这些环境又执行大部分细胞功能，因此确定人源蛋白的亚细胞定位(subcellular localization)对理解其角色及疾病分子机制至关重要。基于氨基酸序列的计算性亚细胞定位预测可帮助识别触发蛋白转运的序列基序(motif)、注释未表征蛋白及解释蛋白错误定位(mislocalization)在疾病中的作用。

现有方法存在明显局限：(1)多数仅支持单标签分类(single-label classification)，忽视近半数人源蛋白具多定位(multilocalization / multilabel localization)特性；(2)沿DeepLoc传统仅预测约十个粗粒度(coarse-grained)区室，忽略精细细胞结构；(3)多在非人源蛋白上评测，忽视物种及细胞类型特异性定位模式；(4)测试集极小（如DeepLoc2仅用1,717个蛋白，覆盖人源组仅约8.5%）。为此，研究人员开展本研究，整合多数据库构建大规模、高置信度、支持多标签及多层次细粒度的人源蛋白亚细胞定位基准数据集(HOU test set)，并基于此系统性重新训练与评测已有模型及不同蛋白质语言模型(protein language models, PLMs)与特征聚合(aggregation)策略组合，揭示现有限制并提出改进方向。

二、主要关键技术方法概述

研究人员整合三个主要蛋白数据库——UniProtKB/SwissProt（真核、已审阅、具实验验证ECO:0000269定位注释）、Human Protein Atlas (HPA) v24（免疫荧光成像、可靠性为Enhanced/Supported/Approved）及OpenCell（CRISPR内源标记荧光显微成像、取grade 3注释），筛选人源蛋白并使用UniProt定义之 canonical isoform，去除非甲硫氨酸起始或少于40残基之序列。建立三级分层标签体系(level 1含21个细粒度区室)，将三库注释映射至标准标签集；构建高置信度测试集HOU (HPA-OpenCell-UniProt test set)：至少两库共同支持至少一个定位标签之蛋白（两库以上重叠），余下HPA与UniProt蛋白构建五折交叉验证训练集，要求训练-测试集及训练折间序列相似度<40% identity（mmseqs2聚类确保同源蛋白不分入不同折）。评测三类已发表模型——DeepLoc2（ProtT5或ESM1b嵌入+单注意力头+focal loss+排序信号KL散度引导）、LAProtT5（ProtT5嵌入+1D卷积+light attention+二元交叉熵多标签）及MULocDeep（PSSM+BiLSTM+attention）——并在HPA-UniProt联合训练集五折交叉验证后于HOU测试集评测。同时系统评测四种PLMs（ESM2、ESM3-small-open、ProtT5、ProtBERT）与四种残基嵌入聚合策略（max pooling、mean pooling、light attention、multi-head attention, MHA）之16种组合，用focal loss或交叉熵训练，阈值以验证集Matthews相关系数(Matthews correlation coefficient, MCC)最大化确定。此外探索：(1)注意力谱与已知分选信号(sorting signals)及PROSITE模体之重叠分析；(2)融合蛋白互作(protein–protein interaction, PPI)网络（STRING高置信>800分、BioPlex 3.0）以GraphSAGE图卷积扩展模型(ProtT5-MHA-PPI)；(3)对Lacoste等实验中经滤选之308个人源蛋白错义变异（169个mislocalized、139个stationary）进行野生型及变异体定位预测以考察模型对致错误定位之致病性错义变异之泛化能力。评价指标含每类及宏/微平均之MCC、F1、精确率(precision)、召回率(recall)、Jaccard指数、精确率–召回率曲线下面积(average precision, AP)等，依多标签分类标准计算。

三、研究结果

Integrating protein databases and constructing train and test sets（整合蛋白数据库并构建训练与测试集）

研究人员将UniProt、HPA、OpenCell注释映射至自行定义之三级分层标签集（Level 1为21个细粒度区室如细胞质(cytosol)、核质(nucleoplasm)、线粒体内膜/基质(mitochondria)、内质网(endoplasmic reticulum, ER)、高尔基体(Golgi apparatus)、过氧化物酶体(peroxisome)、脂滴(lipid droplet)、溶酶体(lysosome)、内吞体(endosome)、质膜(plasma membrane)、细胞骨架亚类——微管(microtubules)、肌动蛋白纤维(actin filaments)、中间丝(intermediate filaments)、核体(nuclear bodies)、核 speckles(nuclear speckles)、核仁原纤维中心(nucleoli-fibrillar center)、核膜(nuclear membrane)、囊泡(vesicles, 作为溶酶体/内吞体/过氧化物酶体/脂滴之父类)等）。发现三库标签粒度差异大（UniProt用>300术语，OpenCell仅17；HPA报告62.9%蛋白有多定位，UniProt 36.7%，OpenCell 31.6%），共有蛋白中<27%标签集完全相同但>80%共享至少一区室。取至少两库重叠且有至少一共识标签之蛋白构成HOU测试集（N=3,814，较DeepLoc2测试集大两倍以上），余下建训练集并确保序列同源性隔离(<40% identity)。结论：成功构建迄今最大之人源蛋白多标签亚细胞定位高置信度基准测试集与相应训练集，可支持公平细致之多标签定位预测器评测。

Benchmarking existing published sequence-based localization predictors（评测已发表之基于序列之定位预测器）

将DeepLoc2、LAProtT5、MULocDeep及随机Bernoulli基线于HOU测试集评测。随标签粒度降低性能上升；所有模型对主要膜结合细胞器（质膜、ER、线粒体）精确率与召回率较高，对细胞骨架亚区室及核子结构（核体、核仁原纤维中心）表现差。LAProtT5整体宏平均精度最高，但偏保守（平均预测标签数<2），DeepLoc2-ProtT5偏多（平均3.5标签）。各类频率影响指标：F1随类大小升高，MCC较稳健不受类不平衡严重影响。结论：现有模型在稀有细粒度区室及多定位蛋白上仍明显不足，PLM-based模型优于PSSM-based MULocDeep。

Systematically evaluating PLMs and aggregation strategies（系统评测蛋白质语言模型与聚合策略）

测试ESM2、ESM3-small-open、ProtT5、ProtBERT分别搭配max/mean pooling、light attention、MHA。max pooling一致较差，mean pooling意外有效（尤对ESM2），ProtT5+MHA与ESM2+mean pooling最优，其中ProtT5-MHA（ProtT5 + multi-head attention）整体宏平均AP最高，超越所有已发表模型。Per-class分析同样显示常见大区室预测佳，稀有/少标注区室（中间丝完全无预测）差。ProtT5-MHA之Precision–Recall曲线对线粒体、核质接近理想，对内吞体、溶酶体差。混淆矩阵示与LAProtT5类似误分类模式（核speckles?核体、脂滴?溶酶体、高尔基?囊泡等），且无法预测中间丝。结论：仔细配对PLM与聚合策略可显著提升定位预测，ProtT5-MHA为最佳参考模型。

Analyzing performance stratified by protein properties（按蛋白性质分层分析性能）

以ProtT5-MHA按单/多定位标签、有无信号肽(signal peptide)/转运肽(transit peptide)、跨膜/膜内蛋白、固有无序蛋白(intrinsically disordered proteins, IDPs)分层评测HOU子集。单定位蛋白准确率高于多定位，但宏平均AP在多定位蛋白略高（因常含大且良标注主区室）。含信号/转运肽者性能显著高（保守分选信号强指示）。膜关联蛋白准确率和宏AP更高（跨膜螺旋等结构基序助分类），固有无序蛋白两者均较低（功能多样且动态定位）。结论：保守序列基序与结构特征增强预测，未来可直接融入结构信息或采用更适配之架构。

Evaluating biologically relevance of attention profiles（评估注意力谱之生物学相关性）

分析ProtT5-MHA之注意力峰与已知分选信号及PROSITE模体重叠：50%注意力峰覆盖分选信号区域，76%分选信号被至少一峰检出；对PROSITE模体重叠仅18%峰覆盖、22%模体被检出（因其多与定位无关）。模型可靠检测除过氧化物酶体靶向信号外几乎所有类型分选信号。对DNA结合域（关联核定位）也表现出注意力集中。从未注释正确预测蛋白之注意力峰聚出若干模糊模体（fuzzy motifs）跨物种保守，提示模型可能捕获潜在新型分选相关序列特征。结论：PLM衍生注意力可在相当程度上聚焦已知生物学相关定位决定基序，具一定可解释性。

Incorporating PPI data into localization predictors（将蛋白互作网络整合入定位预测器）

以GraphSAGE融STRING PPI网络至ProtT5-MHA得ProtT5-MHA-PPI，在有共定位互作者之蛋白上轻微提升（内质网TP增10%、核speckles TP增18%、核仁原纤维中心FP降），但整体宏平均指标无实质超越ProtT5-MHA。STRING互作中同区室互作中位占比<0.5，仅当互作网络中大量互作伙伴共区室时代理消息传递略控假阳性提精密度。结论：当前PPI网络噪声大且不全，简单图扩展不足以全局提效，需更复杂多模态架构针对性利用稀疏共定位互作信号。

Assessing model generalization to pathogenic protein variants (exploratory analysis)（评估模型对致病性蛋白变异之泛化能力——探索性分析）

用Lacoste等经实验验证之308个人源错义变异（169 mislocalized、139 stationary）及其野生型序列测试ProtT5-MHA。野生型F1高，stationary略降，mislocalized大幅降（尤其质膜）。模型仅308例中11例因单残基改变改变预测标签，表明对单位点突变不敏感。多数mislocalized由不稳定或膜插入失败致（非仅排序信号破坏），超出版本序列上下文捕获范畴。结论：当前序列模型难泛化至致错误定位之致病错义变异，未来需变体感知训练及整合结构/稳定性预测方具临床适用性。

四、讨论与结论翻译（浓缩自Discussion）

本研究对人源基于序列之亚细胞定位预测器做了全面基准评测，系统比较已发表方法、PLM及聚合策略，构建并发布HOU高置信多人源多标签定位测试集。即便最优模型ProtT5-MHA在多定位蛋白、稀有细粒度区室及致错误定位之致病错义变异上仍表现有限，揭示现方法根本不足。研究人员建议：(1)显式引导注意力至多分选信号及功能相关序列模体；(2)引入超越氨基酸序列之辅助信息——PPI（需选择性融合架构）、膜插入或结构稳定性预测以提升膜区室及变异预测；(3)长远应开发共嵌入多生物学信号（序列、互作、结构、稳定性）的新一代蛋白表示模型。需注意当前基准及领域仍忽略异构体(isoform)特异性、细胞类型/周期依赖之动态定位及显微图像所含空间连续分布信息；未来序列到图像模型或分布建模优於离散多标签分类，且应考虑局部翻译及生物分子凝聚体(condensates/biomolecular condensates)关联预测。研究人员呼吁加强数据收集、基准标准化及模型研发，推动亚细胞定位预测成为开放且紧迫之挑战。

（全文完）