恶性疟原虫奎宁部分耐药性遗传标志物的鉴定

《Nature Microbiology》：Identification of genetic markers of quinine partial resistance in Plasmodium falciparum

　　

恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）对奎宁（quinine，一种用于治疗重症疟疾的药物）的耐药性遗传基础长期以来一直不清楚。为了研究这一点，研究人员使用人肝嵌合小鼠模型，在奎宁部分耐药与奎宁敏感寄生虫之间进行了恶性疟原虫遗传杂交。对120个独特的重组子代进行药物分析和数量性状位点（quantitative trait loci, QTL）分析，将耐药性定位到第7号和12号染色体的片段，表明其具有多基因基础。基于基因编辑研究，氯喹耐药转运蛋白（chloroquine resistance transporter, PfCRT）和一个结构相似的假定药物/代谢物转运蛋白（putative drug/metabolite transporter, DMT1）被确定为第7号染色体的主要候选基因。在蛋白脂质体实验中，突变型DMT1和PfCRT均比其野生型异构体转运更多的奎宁。DMT1定位于恶性疟原虫的消化液泡、脂质体、寄生泡膜以及与囊泡运输相关的结构。第12号染色体上的一个ATP依赖性锌金属蛋白酶（ATP-dependent zinc metalloprotease, FtsH1）也调节了奎宁和氯喹的耐药性。研究人员建议，在奎宁使用的临床环境中应对这些标志物进行基因型监测。

**论文解读：恶性疟原虫奎宁部分耐药性遗传标志物的鉴定**

**研究背景**

疟疾仍是全球重大公共卫生挑战，2024年估计发生2.82亿例病例和61万例死亡。恶性疟原虫（*Plasmodium falciparum*）引起的无并发症疟疾依赖青蒿素联合疗法（artemisinin-based combination therapies, ACTs），重症疟疾则首选青蒿琥酯。然而，源自东南亚的青蒿素部分耐药性已在多个非洲国家出现，威胁ACT疗效，凸显了寻找具有不同作用机制的替代药物的紧迫性。奎宁（quinine），自17世纪引入以来基本保持疗效，被推荐用于治疗妊娠早期感染和重症疟疾，但低度奎宁耐药性早在1910年即有报告。尽管氯喹耐药转运蛋白基因（*pfcrt*）和多药耐药蛋白1基因（*pfmdr1*）的变异曾被关联，奎宁部分耐药性的遗传基础仍不完全清楚。因此，开展本研究以系统鉴定奎宁耐药性的遗传决定因子。

**研究概述与结论**

研究人员利用人肝嵌合小鼠模型，对奎宁部分耐药株Cam3.II和敏感株NF54进行遗传杂交，获得120个独特重组子代。通过数量性状位点（quantitative trait locus, QTL）分析、CRISPR/Cas9基因编辑、蛋白脂质体转运实验和亚细胞定位等研究，鉴定出**第7号染色体上的PfCRT和DMT1（假定药物/代谢物转运蛋白）**以及**第12号染色体上的FtsH1（ATP依赖性锌金属蛋白酶）** 是奎宁部分耐药性的关键遗传标志物。该研究揭示了奎宁耐药性的多基因基础，为临床使用奎宁时的基因型监测提供了候选分子标志物。论文发表在《Nature Microbiology》。

**关键研究方法**

研究人员使用**人肝嵌合小鼠模型**（FRG NOD huHep mice）进行恶性疟原虫遗传杂交，亲本株为柬埔寨分离的Cam3.II（奎宁部分耐药、氯喹耐药）和东非来源的NF54（两药敏感）。通过批量子代克隆和差异药物选择（奎宁、氯喹）获得120个独特重组单倍型。采用**全基因组测序**（whole-genome sequencing, WGS）进行批量分离分析和子代克隆QTL作图。利用**CRISPR/Cas9基因编辑**技术对*dmt1*、*pfcrt*、*ftsh1*等候选基因进行点突变回复或基因敲除，并通过**蛋白脂质体转运实验**测量[³H]奎宁和[³H]氯喹的摄取。通过**免疫荧光显微镜**和**超分辨率膨胀显微镜**（ultrastructure expansion microscopy, U-ExM）确定DMT1的亚细胞定位。此外，还进行了β-血晶素形成抑制实验和肽组学分析。

**研究结果**

**实施遗传杂交以定位奎宁和氯喹耐药性标志物**：研究人员在Cam3.II与NF54之间实施遗传交叉，通过蚊虫叮咬或静脉注射将重组子孢子感染人肝嵌合小鼠，获得血期重组子代。

**结合批量子代克隆与差异药物选择获得120个独特重组子代**：通过无药压力或不同浓度奎宁、氯喹选择，共获得120个独特重组单倍型。无药压力下82%子代携带野生型*pfcrt*；氯喹选择下所有子代均携带突变型*pfcrt*（Dd2变异型）；奎宁选择后突变型*dmt1*在≥140 nM时高度富集。

**批量分离分析识别出与奎宁耐药性相关的第7号染色体上的两个数量性状位点峰**：对奎宁加压的混合培养物进行WGS和批量分离分析，在第7号染色体发现一个显著QTL峰（距*pfcrt*下游191 kb），与先前未知的耐药标志物区域重叠。

**基于子代克隆的性状定位识别出第7、12号染色体上的耐药性相关峰**：对克隆子代进行72小时药物敏感性测定和QTL作图，奎宁IC₅₀和IC₉₀的最显著QTL峰位于第7和12号染色体，提示多基因性质。氯喹和单去乙基氯喹（md-chloroquine）仅有两个QTL峰，与奎宁共享。

***dmt1*是第7号染色体上的奎宁耐药性候选决定因子**：在优势QTL内33个多态基因中，*dmt1*的LOD值为10.4，位于峰值附近。Cam3.II DMT1携带Y107N和S129L突变。在*pfcrt*野生型子代中，*dmt1* QTL峰依然显著，支持其为独立于*pfcrt*的奎宁耐药性关联候选基因。

**突变型*dmt1*可能在寄生虫对奎宁的敏感性中起调节作用**：利用CRISPR/Cas9将Cam3.II或其他子代中的*dmt1*突变回复为野生型，仅在某些遗传背景（如H079）中显著降低奎宁IC₅₀（约40%），表明其作用依赖遗传背景。

**敲除株的表型分析支持*dmt1*作为奎宁耐药性标志物**：在Cam3.II中敲除*dmt1*，四个独立克隆的奎宁IC₅₀和IC₉₀降低25-30%，对甲氟喹和苯芴醇的敏感性在IC₉₀水平也增加。

**DMT1定位于消化液泡、脂质体、寄生泡膜以及与囊泡运输相关的结构**：免疫荧光显示DMT1部分与消化液泡膜标志物PfCRT、脂质体（Nile Red）、内质网、寄生泡膜（PfEXP2）和早期内体共定位，提示其参与囊泡运输。

**基因编辑确认突变型PfCRT对奎宁耐药性的贡献**：将Cam3.II的*pfcrt* Dd2等位基因回复为野生型后，奎宁IC₅₀和IC₉₀显著降低64%和55%，氯喹敏感性完全恢复，支持PfCRT在奎宁耐药性中的部分作用。

**NF54和Cam3.II的DMT1和PfCRT异构体差异转运[³H]奎宁**：蛋白脂质体实验表明，突变型DMT1和PfCRT较野生型异构体显著增加[³H]奎宁摄取；突变型PfCRT对[³H]氯喹转运最高，而突变型DMT1对其转运较低，与功能作用一致。

**奎宁部分抑制血红素解毒**：在无细胞β-血晶素形成抑制实验中，奎宁和甲氟喹的抑制活性（IC₅₀约22.1和33.8 μM）弱于氯喹和单去乙基阿莫地喹，支持其在血红素解毒中的次要作用。

**第12号染色体峰包含与奎宁和氯喹耐药性相关的* samc *、* thzk *和* ftsh1***：在该QTL峰内10个多态基因中优先选择* samc *、* ftsh1 *和* thzk *作为候选。在Cam3.II中分别回复* samc *和* thzk *为野生型未改变药物敏感性，而回复* ftsh1 *突变（D695G）则显著降低对奎宁、氯喹和md-氯喹的耐药性（33-50%）。

**肽组学分析揭示*pfcrt*、*dmt1*和12号染色体位点参与调节寄生虫内血红蛋白衍生肽的水平**：突变型*pfcrt*寄生虫中血红蛋白衍生肽水平升高，该升高在携带突变*pfcrt*、野生型*dmt1*和突变*thzk/ftsh1/samc*的子代H046中部分逆转，提示*dmt1*和12号染色体位点的调节作用。

**总结讨论与结论**

该研究鉴定出与奎宁部分耐药性相关的三个遗传标志物——*dmt1*、*pfcrt*和*ftsh1*，揭示了奎宁耐药性的多基因基础。DMT1的结构与PfCRT相似，其突变形式可能通过将奎宁从作用位点转运出去而参与耐药性；FtsH1则可能通过影响顶质体功能间接调控耐药性。流行病学数据显示，Cam3.II的DMT1单倍型（Y107N/S129L）在东南亚与Dd2型PfCRT高度共现。研究建议在奎宁使用的临床环境中监测*pfcrt*、*dmt1*和*ftsh1*等位基因频率的变化。研究结论强调，奎宁作为最古老的抗疟药物仍然广泛有效，未来药物发现应优先选择具有多个恶性疟原虫特异性靶点或多个低水平耐药性调节因子的化合物。