快速转录动态导致急性髓系白血病对阿糖胞苷产生耐药性

《Blood Cancer Discovery》：Rapid Transcription Dynamics Confers Cytarabine Resistance in Acute Myeloid Leukemia

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摘要

化疗耐药性仍是癌症患者治疗中的重大挑战，其中包括急性髓系白血病。虽然基因突变可能导致耐药性，但快速适应性的非基因机制，尤其是转录动态的作用，目前仍不甚明了。在本文中，我们发现用广泛使用的化疗药物阿糖胞苷处理AML细胞短期内，会导致细胞群中出现具有显著RNA诱导和更强阿糖胞苷耐药性的细胞，这一现象在细胞系和患者原始样本中均有体现。从机制上讲，通过单分子RNA FISH技术对转录动态进行转录组学和高效分辨率分析，发现转录动态迅速被激活，关键转录因子也被上调——我们将这些因子称为“阿糖胞苷快速反应转录因子”。在功能层面，短期使用RNA转录抑制剂在体外和体内均能抑制化疗引起的RNA诱导，从而防止耐药性的产生。此外，通过CRISPR技术抑制PU.1和GATA1转录因子也能显著减弱阿糖胞苷耐药性。我们的研究揭示了快速适应性转录动态在AML化疗耐药性中的作用。

意义：本研究明确了快速适应性转录动态在AML化疗耐药性中的作用，指出关键转录因子是调控此过程的核心。这些发现为缓解化疗耐药这一重要临床问题提供了具有药物可及性的新策略。

引言

急性髓系白血病是一种预后极差的血液系统恶性肿瘤，其高复发率更是加剧了这一状况。尽管化疗取得了进展，但对于许多无法接受强化骨髓移植的老年患者而言，5年总生存率仍低于20%。复发性和难治性AML仍然是这些患者死亡的主要原因，这凸显出迫切需要新的治疗策略来克服化疗耐药性。目前已对AML化疗耐药性的基因机制进行了大量研究，进而开发出了针对耐药相关基因突变的靶向疗法。例如，吉列替尼和波那替尼分别对由化疗诱发的FLT3-D835和BCR::ABL-T315I突变在BCR::ABL1 AML中的疗效显著。然而，正如一项荟萃分析所示，约40%的复发AML病例在复发时并无可识别的基因突变，这说明仅靠靶向疗法不足以完全消除化疗耐药性。这一现象表明，非基因机制也在化疗耐药性的形成中起着关键作用。鉴于人们越来越认识到非基因因素在化疗耐药性中的作用，我们着手研究转录动态在AML阿糖胞苷耐药性发展中的作用。此前的研究，包括我们自己的研究，已经发现，在人类癌细胞系以及小鼠模型的原始干细胞中，快速的转录动态和变异性在细胞发育、分化和疾病进展过程中的细胞命运决定中起着重要作用，这提示转录可塑性也可能参与化疗耐药性的形成。虽然有研究将转录变异与黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌等实体瘤的耐药性联系起来，但在白血病治疗背景下，这类机制尚未得到系统研究。阿糖胞苷仍是AML化疗的重要药物，其作用机制和代谢途径已被充分研究。然而，AML细胞如何获得对阿糖胞苷的耐药性，以及如何通过治疗逆转这一过程，其具体的分子机制仍不完全清楚。为填补这一空白，我们研究了阿糖胞苷处理后转录动态的作用，旨在寻找减轻阿糖胞苷耐药性的新策略。我们发现，阿糖胞苷处理会触发AML细胞中快速的RNA诱导反应，而这一反应在转录动态介导的耐药性形成中起关键作用。重要的是，在阿糖胞苷处理前后使用药物抑制转录，能够有效阻止这种RNA诱导，从而使阿糖胞苷敏感性恢复到初始水平。通过包括单分子水平在内的高效分辨率转录分析，我们发现了在阿糖胞苷处理后1天内迅速激活的关键转录因子，如PU.1和GATA1。抑制这些“阿糖胞苷快速反应关键转录因子”能够显著减弱耐药性的形成，这证明关键转录因子的快速转录动态直接导致了早期化疗耐药性的产生。将阿糖胞苷与RNA转录抑制剂联合使用，能够在体内AML异种移植模型中显著延长肿瘤抑制时间，体现了这种联合疗法的治疗潜力。总体而言，我们的研究确定快速转录动态是早期阿糖胞苷耐药性的重要驱动因素，并为开发以转录为靶点的联合疗法以减轻AML化疗耐药性提供了依据。

结果

短期RNA诱导是早期获得适应性阿糖胞苷耐药性的原因

为识别和研究化疗耐药性的非基因机制，我们首先检测了短期阿糖胞苷处理对多种人类AML细胞系（HL60、NB4和MOLM14）的影响。这些细胞以约IC95剂量的阿糖胞苷处理3天（第0–3天），在细胞生长恢复后的时间点（第14天）检测时，所有细胞类型都表现出中度但显著的阿糖胞苷耐药性，且这一耐药性在第28天仍然保持稳定（图1A；补充图S1A）。有趣的是，即使仅用相同剂量的阿糖胞苷处理细胞1天，第28天也出现了显著耐药性（补充图S1B）。图1. 查看大图 下载幻灯片 阿糖胞苷处理后的RNA诱导与阿糖胞苷耐药性的形成有关。A，第14天时HL60、NB4和MOLM14细胞对阿糖胞苷的增殖剂量-反应曲线（n = 4；技术重复样本）。这些细胞分别用250 nmol/L的阿糖胞苷处理HL60细胞，用500 nmol/L的阿糖胞苷处理NB4和MOLM14细胞，处理时间为3天。实验重复样本显示平均值±标准差。条形图显示了每类细胞阿糖胞苷的IC50值（平均值±标准差）（n = 4；技术重复样本）。**，经非配对t检验，P < 0.01。B，用乙炔尿苷标记检测HL60、NB4和MOLM14细胞在用上述相同剂量阿糖胞苷或DMSO处理1天后的RNA合成情况的代表性流式细胞术直方图。该分析通过DAPI染色筛选出活细胞，x轴显示乙炔尿苷掺入的荧光强度，反映RNA合成活性水平。条形图显示了每类细胞在DMSO或阿糖胞苷处理后EU平均荧光强度的总体倍数变化（n = 3；技术重复样本）。*，经非配对t检验，P < 0.05；**，经非配对t检验，P < 0.01。C，用吡罗宁Y检测HL60细胞在用250 nmol/L阿糖胞苷处理3天后，第1、3、7、14和28天的RNA表达情况的代表性流式细胞术直方图。通过Hoechst 33342染色筛选出处于G0–G1细胞周期阶段的活细胞，x轴显示吡罗宁Y的荧光强度，反映RNA含量水平。条形图显示了每个时间点在DMSO或阿糖胞苷处理后MFI数据的总体倍数变化（n = 3–4；技术重复样本）。**，经非配对t检验，P < 0.01；***，经非配对t检验，P < 0.001。D，用于评估吡罗宁Y分选细胞对阿糖胞苷敏感性差异的实验示意图。底部显示了对照组和阿糖胞苷处理细胞的代表性流式细胞术数据，PYHigh门限定义为对照组中G0–G1细胞周期阶段细胞比例小于1%的区域。E，HL60细胞在用250 nmol/L阿糖胞苷处理1天后，第14天和第28天，未处理对照组、阿糖胞苷处理组以及阿糖胞苷处理组中PYLow和PYHigh分选细胞群的阿糖胞苷敏感性变化。每个时间点的IC50值倍数变化是通过将阿糖胞苷处理组、PYLow分选组和PYHigh分选组的IC50值除以对照组的相关值来计算的（n = 4；技术重复样本）。**，经非配对t检验，P < 0.01；***，经非配对t检验，P < 0.001。Ctrl，对照组。关闭模态框

为检测阿糖胞苷处理后的细胞是否出现了重大的基因突变，我们让HL60细胞用250 nmol/L的阿糖胞苷处理3天，然后在第14天进行全外显子组测序。我们并未观察到任何优势基因克隆的出现或选择。对照组和处理组细胞的变异等位基因频率高度相关（Pearson R = 0.961；补充图S2A）。我们在阿糖胞苷处理后观察到的基因突变相对较少[3个插入/缺失突变和30个单核苷酸变异]（补充表S1）。所有变异的出现频率都很低，且涉及的基因据我们所知此前并未与阿糖胞苷耐药性相关联，这表明在短期处理条件下，并未出现带有耐药相关基因突变的优势克隆。由于这些结果表明，非常短期的阿糖胞苷暴露就足以通过适应性非基因机制引发耐药性，因此我们接下来研究了阿糖胞苷处理后的RNA转录动态。我们首先通过用乙炔尿苷标记新生RNA来检测RNA合成活性的变化，乙炔尿苷是一种仅能掺入新转录RNA中的尿苷类似物。令人惊讶的是，在所有三种细胞系HL60、NB4和MOLM14中，与未处理的对照组相比，阿糖胞苷处理1天后，绝大多数细胞的新生RNA转录活性更高（图1B）。接着，我们结合RNA分析和细胞周期分析，来监测RNA表达水平的变化。由于处于有丝分裂阶段的细胞很容易受到阿糖胞苷的处理影响，因此我们将分析范围限制在G0–G1细胞周期阶段的细胞。经过3天的阿糖胞苷处理后，G0–G1阶段的细胞RNA表达水平显著且迅速上升，而在停止处理后很快就恢复了稳定状态，尽管此时阿糖胞苷处理过的细胞仍表现出对阿糖胞苷的耐药性（图1C；补充图S1C、S1D和S1E）。使用SYTO RNASelect染料替代吡罗宁Y进行RNA染色的一种替代方法也显示，在处理后第1天整体RNA水平有所上升，不过并未进行量化测定（补充图S1F）。这些数据表明，短期AraC处理后会出现RNA诱导现象。为评估AraC处理后产生的RNA诱导细胞群的功能作用，我们在AraC处理1天后对吡罗宁Y高表达细胞（PYHigh）和低表达细胞（PYLow）进行了流式分选，然后在细胞生长恢复后检测了它们对AraC的敏感性（图1D）。令人惊讶的是，PYHigh细胞对AraC的抵抗性显著高于PYLow细胞（图1E；补充图S1G），这表明AraC处理后的RNA诱导在获得对AraC的快速抵抗性方面具有功能意义。为探究是否存在特定基因定义的克隆在这类RNA高表达亚群中扩增，我们对流式分选的PYHigh和PYLow细胞进行了全外显子组分析。与未分选细胞的分析结果一致，我们并未在PYHigh或PYLow细胞中发现任何基因突变的出现或选择（皮尔逊相关系数为0.958；补充图S2B）。抑制mRNA诱导可防止过早获得对AraC的抵抗性。

为进一步了解AraC处理后RNA诱导与抗药性之间的关系，我们测试了四种不同的RNA转录抑制剂——放线菌素D、BET蛋白降解剂dBET6、CX5461和椭圆霉素——抑制RNA诱导的效果。放线菌素D能干扰所有类型的RNA合成，而dBET6则通过阻止RNA聚合酶II延长复合物的组装来选择性地抑制mRNA转录的激活。相比之下，CX5461和椭圆霉素都是RNA聚合酶I抑制剂，它们会中断核糖体RNA的合成。为研究这些RNA转录抑制剂对AraC诱导的RNA诱导的影响，我们分别用500 pmol/L的放线菌素D、5 nmol/L的dBET6、10 nmol/L的CX5461或10 nmol/L的椭圆霉素预处理HL60细胞，以在尽可能不影响细胞生长的情况下发挥作用（生长抑制约20%）。在用RNA转录抑制剂预处理3天后，再让细胞与AraC及相应剂量的药物共同作用1天（补充图S3A）。经AraC和放线菌素D或dBET6共同处理后，HL60细胞中的RNA合成显著下降，分别仅为AraC单独处理细胞的21%和27%（图2A）。出乎意料的是，当使用AraC与RNA聚合酶I抑制剂共同处理时，RNA合成仅出现轻微变化，尽管仅用RNA聚合酶I抑制剂处理3天后，前体rRNA水平已显著下降（图2A和B；补充图S3B）。同样地，用吡罗宁Y测定的整体RNA表达水平在经AraC和放线菌素D或dBET6共同处理后也有所下降，并恢复到AraC单独处理且用二甲基亚砜处理的HL60细胞的水平，分别为AraC处理细胞的72%和73%，而AraC与RNA聚合酶I抑制剂共同处理时则无显著变化，分别为AraC处理细胞的98%和93%（图2B）。这一结果在其他两种急性髓系白血病细胞系中也得到验证（补充图S3C和S3D），说明所诱导的RNA是由RNA聚合酶II转录的，因此可以被放线菌素D和dBET6在预处理或同时处理时阻断，但无法被RNA聚合酶I抑制剂阻断。图2. 查看大图 下载幻灯片。AraC引发的RNA诱导抑制可防止获得对AraC的抵抗性。A和B为HL60细胞在用500 pmol/L的放线菌素D、5 nmol/L的dBET6、10 nmol/L的CX5461或10 nmol/L的椭圆霉素预处理3天，再与250 nmol/L的AraC及相同剂量的各药物共同处理1天后，通过乙炔尿苷标记检测RNA合成情况以及用吡罗宁Y检测RNA含量的典型流式细胞术直方图。所有数据均与DMSO对照组以及AraC单独处理1天的细胞数据进行了对比。通过DAPI（A）或Hoechst 33342染色筛选出活细胞，排除了死亡细胞。条形图总结了每种药物处理后平均荧光强度的倍数变化。对于A和B，倍数变化是通过将处理细胞的MFI值除以DMSO对照组的MFI值来计算的（n=3；技术重复样本）。**，P<0.01；***，P<0.001，通过非配对t检验得出。C–F为在用500 pmol/L的放线菌素D（C）、5 nmol/L的dBET6（D）、10 nmol/L的CX5461（E）和10 nmol/L的椭圆霉素（F）预处理3天，再与250 nmol/L的AraC及相同剂量的各药物共同处理3天后，第28天AraC敏感性的变化情况。IC50值的倍数变化是通过将各处理组细胞的IC50值除以对照组的IC50值来计算的（n=3–4；技术重复样本）。*，P<0.05；**，P<0.01，通过非配对t检验得出。ns，无显著性差异。关闭模态窗口。

随后，为检测抑制RNA诱导是否能够减缓AraC抗药性的发展，我们评估了在用RNA转录抑制剂预处理3天，再与AraC及相应剂量的RNA转录抑制剂共同处理3天后的AraC敏感性（补充图S3A）。令人瞩目的是，AraC与放线菌素D或dBET6联合处理后，28天时细胞的AraC敏感性可恢复到未经处理的对照组水平，而RNA聚合酶I抑制剂则对AraC抗药性没有显著影响（图2C–F；补充图S3E–S3H）。这些数据表明，RNA聚合酶II介导的mRNA转录增强是导致AraC快速且早期抗药性产生的原因，而抑制mRNA水平上升可防止急性髓系白血病细胞过早获得对AraC的抵抗性。预先抑制mRNA转录可提高AraC在体内的抗白血病效果。

为检测mRNA转录抑制对体内AraC治疗的效果，我们将HL60或NB4细胞皮下移植到NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠体内，监测单独用AraC处理或先使用RNA聚合酶II转录抑制剂dBET6处理后再用AraC处理时白血病细胞生长的变化情况（详细内容见“方法”部分）。对照组小鼠或仅用dBET6处理的小鼠中，白血病细胞生长并无显著差异，而在AraC处理结束时（第6天），AraC处理小鼠的白血病细胞生长出现了明显但显著的抑制。此时，同时用dBET6和AraC处理的小鼠，其白血病细胞生长抑制更为显著[P<0.01（HL60）和P<0.0001（NB4）；图3A–F]。值得注意的是，停止使用AraC后，AraC的抑癌效应并未持续，仅用AraC处理的小鼠的细胞生长立即加速。而同时用dBET6和AraC处理的小鼠，其白血病细胞生长抑制可持续约14天（HL60细胞）和16至18天（NB4细胞）（图3A和E）。此时，同时用dBET6和AraC处理的小鼠的白血病细胞生长仅为AraC单独处理小鼠的17%（HL60细胞）或36%（NB4细胞），这一差异具有高度统计学显著性[P<0.0001（HL60）和P=0.0004（NB4）；图3A和D]。图3. 查看大图 下载幻灯片。dBET6抑制AraC诱导的RNA诱导可在体内肿瘤模型中更长时间地阻止肿瘤生长。A为将HL60细胞皮下移植到NSG小鼠体内后，于肿瘤部位分别用dBET6（150 μg/肿瘤/天，第1–6天）、AraC（2 mg/肿瘤/天，第4–6天）或两者同时处理时，肿瘤的生长曲线（每种处理条件下n=7–8只小鼠；生物重复样本）。标准化肿瘤体积是将第0天（开始用dBET6处理时）的肿瘤体积设为1，以此表示相对体积。**，P<0.01；****，P<0.0001，通过非配对t检验得出。B和C为实验A中第6天（所有处理完成后立即）NSG小鼠皮下肿瘤的典型照片（B）以及切取的HL60细胞肿瘤的典型照片（C）。比例尺为1厘米。D为将NB4细胞皮下移植到NSG小鼠体内后，于肿瘤部位分别用dBET6（50 μg/肿瘤/天，第1–6天）、AraC（3 mg/肿瘤/天，第4–6天）或两者同时处理时，肿瘤的生长曲线（每种处理条件下n=7–8只小鼠；生物重复样本）。标准化肿瘤体积与A相同。***，P<0.001；****，P<0.0001，通过非配对t检验得出。E和F为实验D中第6天NSG小鼠皮下肿瘤的典型照片（E）以及切取的NB4细胞肿瘤的典型照片（F）。比例尺为1厘米。G为实验A中第6天NSG小鼠体内移植瘤肿瘤细胞用吡罗宁Y检测RNA表达的典型流式细胞术直方图。通过Hoechst 33342染色筛选出处于G0–G1细胞周期阶段的活细胞，x轴表示吡罗宁Y的荧光强度。条形图总结了与DMSO对照组相比，分别用DMSO、AraC、dBET6或两者同时处理后，平均荧光强度的倍数变化情况（每种处理条件下n=3；生物重复样本）。***，P<0.001；****，P<0.0001，通过非配对t检验得出。H为实验A中第6天NSG小鼠体内移植瘤肿瘤细胞用吡罗宁Y检测RNA表达的典型流式细胞术直方图。通过Hoechst 33342染色筛选出处于G0–G1细胞周期阶段的活细胞，x轴表示吡罗宁Y的荧光强度。条形图总结了与DMSO对照组相比，分别用DMSO、AraC、dBET6或两者同时处理后，平均荧光强度的倍数变化情况（每种处理条件下n=3；生物重复样本）。***，P<0.001；****，P<0.0001，通过非配对t检验得出。图3. 查看大图 下载幻灯片。dBET6抑制AraC诱导的RNA诱导可在体内肿瘤模型中更长时间地阻止肿瘤生长。A为将HL60细胞皮下移植到NSG小鼠体内后，于肿瘤部位分别用dBET6（150 μg/肿瘤/天，第1–6天）、AraC（2 mg/肿瘤/天，第4–6天）或两者同时处理时，肿瘤的生长曲线（每种处理条件下n=7–8只小鼠；生物重复样本）。标准化肿瘤体积将与A相同。**，P<0.01；****，P<0.0001，通过非配对t检验得出。B和C为实验A中第6天（所有处理完成后立即）NSG小鼠皮下肿瘤的典型照片（B）以及切取的HL60细胞肿瘤的典型照片（C）。比例尺为1厘米。D为将NB4细胞皮下移植到NSG小鼠体内后，于肿瘤部位分别用dBET6（50 μg/肿瘤/天，第1–6天）、AraC（3 mg/肿瘤/天，第4–6天）或两者同时处理时，肿瘤的生长曲线（每种处理条件下n=7–8只小鼠；生物重复样本）。标准化肿瘤体积是指将第0天（dBET6开始时）的肿瘤体积设为1时的相对体积。***，P<0.001；****，P<0.0001，通过非配对t检验得出。E和F为实验(D)中第6天（所有处理完成后立即）NSG小鼠皮下肿瘤以及NB4细胞切除肿瘤的代表性照片。比例尺为1厘米。G为第6天NSG小鼠移植瘤肿瘤细胞中利用吡罗宁Y检测RNA表达的代表性流式细胞术直方图。通过Hoechst 33342染色筛选出处于G0–G1细胞周期阶段的活细胞，x轴表示吡罗宁Y的荧光强度。条形图显示了与DMSO对照组相比，使用DMSO、AraC、dBET6或两者联合处理后平均荧光强度(MFI)数据的总体倍数变化情况（每种处理条件下n=3，为生物学重复样本）。***，P<0.001；****，P<0.0001，通过非配对t检验得出。H为第6天NSG小鼠移植瘤肿瘤细胞中利用吡罗宁Y检测RNA表达的代表性流式细胞术直方图。通过Hoechst 33342染色筛选出处于G0–G1细胞周期阶段的活细胞，x轴表示吡罗宁Y的荧光强度。条形图显示了与DMSO对照组相比，使用DMSO、AraC、dBET6或两者联合处理后MFI数据的总体倍数变化情况（每种处理条件下n=3，为生物学重复样本）。***，P<0.001；****，P<0.0001，通过非配对t检验得出。

对AraC处理结束时（第6天）白血病细胞中RNA表达水平的分析表明，体内经AraC处理的肿瘤细胞中整体RNA表达水平上升[分别为未处理对照组的112%（HL60，P<0.0001）和127%（NB4，P<0.0001）；见图3G和H]，这一结果与我们在体外模型中的发现相似（见图2）。相比之下，经AraC + dBET6处理的 mice中的白血病细胞RNA表达水平恢复到与未处理mice相同的水平[分别为未处理对照组的98%（HL60，P>0.05）和105%（NB4，P>0.05）；见图3G和H]。综合这些数据可知，在AraC处理之前及处理过程中预先抑制mRNA的诱导，可显著提高AraC的敏感性，并在体内产生更持久的抗白血病效果。AraC处理后会激活ARR-TF信号通路。

为探究与获得AraC耐药性相关的整体mRNA转录组变化，我们对未处理的对照细胞以及处于G0–G1细胞周期阶段的、经250 nmol/L AraC处理1天的HL60细胞进行了RNA测序（RNA-seq）（见图4A和B）。我们发现对照细胞与AraC处理细胞之间有一部分基因的表达存在显著差异（见图4B）。基因集富集分析（GSEA）显示，AraC处理细胞中与转录因子DNA结合活性相关的特征得到富集，这表明AraC处理后转录因子的活性似乎有所增强（见补充图S4A）。已有研究表明，转录因子表达及调控网络的动态变化是决定药物耐药性下细胞命运转变的关键因素，比如分化阻滞和细胞死亡抑制等（27）。因此，我们接下来研究了AraC处理后关键造血相关转录因子的基因调控网络的变化。有趣的是，GSEA显示，与造血相关的几种主要转录因子，如PU.1、GATA1、RUNX1和CEBPA，在AraC处理细胞中的靶基因特征比未处理对照细胞更为富集（见图4C），而其他一些转录因子，如FOXO4和MYC，在AraC处理细胞中的靶基因特征则减弱（见补充图S4B）。这提示有些转录因子，我们将其称为ARR-TFs，可能特异性地参与了非遗传性AraC耐药性的快速形成。值得注意的是，批量RNA-seq未能检测到这些转录因子表达的变化，而且像GATA1这样的某些转录因子其表达水平甚至低于检测限（见补充图S4C）。接下来，我们对PYHigh和PYLow类型的HL60细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），在均匀流形近似投影（UMAP）分析中并未观察到这两类细胞之间存在具有明显转录差异的群体（见补充图S4D）。这说明这两种状态之间的整体转录组差异较为微妙，可能被基于液滴技术的单细胞平台本身较高的信噪比所掩盖。尤其需要指出的是，由于表达水平较低，许多ARR-TFs仅能勉强检测到或根本无法检测到（见补充图S4E）。具体而言，GATA1、FOXO4和HOXA11在scRNA-seq数据集中完全无法检测到。尽管在单个转录因子层面存在上述灵敏度问题，但我们仍观察到PYHigh组中PU.1和GATA1的靶基因评分显著升高，同时这些靶基因的个体表达水平也显著上升（见补充图S4F和S4G）。我们还观察到RUNX1和CEBPA的靶基因评分有轻微但显著的升高，它们的部分下游靶基因在PYHigh组中的表达水平也显著更高（见补充图S4H和S4I）。图4. 查看大图 下载幻灯片 “AraC反应”：AraC处理后会迅速激活主要转录因子。A为全面评估G0–G1细胞周期阶段对照细胞与AraC处理细胞之间基因谱差异的实验方案。HL60细胞先经AraC处理1天，随后进行mRNA-seq检测。B为(A)中mRNA-seq数据的热图展示，反映了HL60对照组细胞以及经250 nmol/L AraC处理1天的细胞在G0–G1阶段的整体转录组变化（n=3，为技术重复样本）。C为在对照组与AraC处理组实验中，对PU.1、GATA1、RUNX1和CEBPA的靶基因集进行的GSEA分析。D为处理1天后，对照组（上方；DMSO处理）和250 nmol/L AraC处理组（下方）HL60细胞中PU.1、GATA1、RUNX和CEBPA的代表性smFISH图像。转录因子转录本以白色伪彩色显示，DNA以蓝色伪彩色显示。比例尺为5微米。E为展示对照组与AraC处理组HL60细胞中PU.1、GATA1、RUNX1和CEBPA的每个细胞中成熟mRNA数量的维恩图。这些细胞分别经DMSO或250 nmol/L AraC处理1天。数值和横条表示平均值。****，通过非参数Mann–Whitney U检验，P<0.0001。F为处理1天后，对照组（DMSO处理）和250 nmol/L AraC处理组HL60细胞中PU.1、GATA1、RUNX和CEBPA的每个细胞中的TS爆发频率（p为n=3的汇总数据，为技术重复样本）。G和H为处理1天后，对照组（DMSO处理）和250 nmol/L AraC处理组HL60细胞中PU.1、GATA1、RUNX和CEBPA的每个细胞中的新生mRNA分子数（G），以及每个TS中的新生mRNA分子数（H）。数值和横条表示平均值。****，通过非参数Mann–Whitney U检验，P<0.0001。I为在多重smFISH实验中同时获得的PU.1、GATA1和RUNX1转录本数据集的t-SNE可视化图。每个点代表一个单独的细胞，颜色划分如下：对照细胞为灰色，AraC处理细胞为深红色。仅在AraC处理细胞中出现的、具有PU.1、GATA1和RUNX1独特表达状态的细胞群用黑线标出。J为在t-SNE分析结果（I）中从AraC处理细胞中提取的AraC诱导细胞群，以及AraC处理HL60细胞中的另一细胞群中PU.1、GATA1和RUNX1的每个细胞中成熟mRNA数量的维恩图。横条表示平均值。****，通过非参数Mann–Whitney U检验，P<0.0001。NES为标准化富集得分；ns表示无显著性意义。关闭模态框。

AraC处理后ARR-TFs的转录爆发频率增加。

为以尽可能高的分辨率研究AraC处理后的转录因子动态变化，我们对ARR-TFs以及其他作为对照的转录因子进行了单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）检测。smFISH是用于高分辨率检测转录爆发现象的黄金标准技术。我们首先分析了经250 nmol/L AraC处理1天后HL60细胞中ARR-TFs，即PU.1、GATA1、RUNX1和CEBPA的转录动态，发现这些转录因子的成熟mRNA水平均显著升高（见图4D和E）。我们还观察到转录起始位点（TS）的爆发频率显著增加（具有活跃TS爆发位的细胞占比分别为27%、1.0%、6.4%和17%，而处理后这一比例上升至62%、3.4%、69%和39%；见图4F），同时每个细胞中的总新生转录本数量也显著增加（分别为2.1、0.1、0.6和1.1，而处理后上升至5.7、0.2、6.9和1.9个mRNA分子；见图4G）。不过有趣的是，当我们分析每个TS的新生转录本总数（即爆发大小）的变化时，发现PU.1和GATA1的爆发大小没有显著变化（分别为5.5、6.1，而处理后变为5.6、4.9个RNA/TS；见图4H），甚至RUNX1和CEBPA的爆发大小还有所下降（分别为8.5、6，而处理后变为6、3.6个RNA/TS；P<0.0001；见图4H）。这表明AraC处理后ARR-TFs的快速升高并非由于单个TS的爆发大小增加，而是由于爆发频率的增加。相比之下，当我们检测另外四种与造血相关的转录因子，即HOXA11、LYL1、FOXO4和MYC时，发现经AraC处理1天后它们的mRNA表达水平没有变化，甚至略有下降（分别为8.7、51、15和278个平均mRNA/细胞，而处理后变为8、47、16和300个；见补充图S5A和S5B）。我们还发现这些转录因子的TS爆发频率没有变化（HOXA11、LYL1和MYC），或者仅有非常轻微的增加（FOXO4；见补充图S5C）。同样，每个细胞中的总新生转录本数量（见补充图S5D）以及每个TS中的总新生转录本数量（见补充图S5E）在AraC处理后也没有变化，或者仅出现微弱变化。为进一步了解“AraC响应”转录因子在单细胞层面的单分子表达动态，我们使用多重smFISH技术，在AraC处理1天后同时检测了三种转录因子（PU.1、GATA1和RUNX1）的表达变化。我们采用t分布随机邻域嵌入（t-SNE）技术来可视化这些转录因子表达的差异，结果发现存在一类独特的细胞群体，这类细胞在AraC处理后这三种转录因子的表达水平均有所升高（见图4I和J）。我们检测了不同急性髓系白血病细胞以及NB4细胞中相同转录因子的转录动态，结果发现，在AraC处理后，“ARR转录因子”PU.1、GATA1、RUNX1和CEBPA始终处于激活状态，而另外四种转录因子（HOXA11、LYL1、FOXO4和MYC）则没有这种变化（补充图S6A–S6J）。此外，t-SNE可视化分析显示，在AraC处理1天后，有一类细胞同时高表达这三种转录因子PU.1、GATA1和RUNX1（补充图S6K和S6L），这表明这些关键转录因子可能在AraC处理后的快速转录动态中起核心作用。为进一步探究，我们在HL60细胞中于AraC处理后第0天、第1天和第14天进行了转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）（补充图S7）。HL60细胞先以250纳米摩尔/升的浓度接受AraC处理1天（第1组细胞），然后再用该浓度处理3天，之后在对照培养基中继续培养11天（第14组细胞）。鉴于短期AraC处理后会引发整体mRNA水平的上升，我们推测AraC会促使启动子可及性普遍增加。然而，以转录起始位点为中心的热图和曲线图（补充图S7A）并未显示出三个时间点上启动子可及性存在显著的整体变化。接下来，我们聚焦于特定转录因子靶标的可及性。在处理第1天和第14天采集的样本中，火山图（补充图S7B）显示，尽管大多数PU.1和GATA1的靶标位点保持稳定，但仍有轻微的趋势趋向于“开放”状态（即可及性增加），而非“关闭”状态，不过这一趋势并未达到统计学上的显著性。第1天的基因集富集分析也支持了这一趋势（补充图S7C），结果显示PU.1和GATA1的靶标都呈现正的富集评分，对应着“开放”的染色质区域。尽管存在这些细微变化，但染色质重塑的程度似乎与单分子mRNA数据所显示的显著转录变化并不匹配。这些数据表明，药物耐药表型主要是由转录重编程驱动的，而非广泛的染色质变化所致。

随后，我们研究了12例原发性急性髓系白血病患者来源的Lin-CD34+造血干细胞和前体细胞在AraC处理后的转录动态。值得注意的是，来自急性髓系白血病样本的造血干细胞在经过1微摩尔/升AraC处理1小时后，出现了适度但显著的RNA水平上升（图5A和B；补充图S8A）。图5显示，原发性急性髓系白血病患者细胞在AraC处理后会出现RNA水平上升以及“AraC反应”转录因子表达升高。A图为使用pyronin Y检测HSPC中RNA表达的流式细胞术统计图，样本为经过1微摩尔/升AraC或DMSO处理的原发性急性髓系白血病患者外周血白细胞分离物中的CD34+细胞群。B图为各患者（n=3，技术重复样本）在DMSO或AraC处理后pyronin Y数据平均荧光强度的倍数变化总结图。*表示P<0.05，**表示P<0.01，通过非配对t检验得出。C–G图为患者1至5的对照组（DMSO处理）和1微摩尔/升AraC处理组细胞中PU.1、GATA1、RUNX1和CEBPA的成熟mRNA含量柱状图。细胞分别用1微摩尔/升AraC或DMSO处理1天，数值和横条代表平均值。*表示P<0.05，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，通过非参数Mann–Whitney U检验得出。H图为患者1的对照组和1微摩尔/升AraC处理组细胞在处理1天后，PU.1、GATA1、RUNX和CEBPA的TS爆发频率 per细胞值。I图和J图分别为患者1的对照组和1微摩尔/升AraC处理组细胞在处理1天后，PU.1、GATA1、RUNX和CEBPA的每个细胞中的新生mRNA分子数（E）以及每个TS产生的新生mRNA分子数（F）。数值和横条代表平均值。**表示P<0.01，通过非参数Mann–Whitney U检验得出。ns表示无显著性差异。

我们还在原发性患者样本中利用smFISH技术研究了ARR转录因子的单分子转录动态。在1微摩尔/升AraC处理1天后，原发性急性髓系白血病样本（患者1–5）中PU.1、GATA1、RUNX1和CEBPA的成熟mRNA水平显著升高（图5C–G）。在患者1的样本中，我们还观察到PU.1、GATA1和RUNX1的TS爆发频率显著上升——具有活跃TS爆发位点的细胞比例从3.5%、1.4%和2.3%分别上升至7.1%、4.2%和5.4%（图5H）；同时每个细胞中的总新生转录本数量也有所增加，分别为0.2、0.06和0.07，上升至0.4、0.16和0.21个mRNA分子（图5I）。而在患者1的样本中，这四种转录因子在AraC处理后的每个TS产生的新生转录本数量并无显著变化（图5J），这一结果与我们在急性髓系白血病细胞系中的观察一致。ARR转录因子在获得AraC耐药性中起重要作用。

由于转录动态分析表明关键转录因子能被AraC迅速诱导，我们推测这些特定转录因子在获得快速耐药性过程中起着功能性作用。为验证这一假设，我们选择了两种ARR转录因子PU.1和GATA1，以及两种在AraC处理后未被改变的对照转录因子HOXA11和LYL1，然后在HL60细胞中通过CRISPR-Cas9技术对其进行了敲除。CRISPR-Cas9处理使得PU.1、GATA1、HOXA11和LYL1在细胞中的mRNA分子数量分别比对照组减少了78.2%、58.8%、63.3%和78.1%（图6A–D）。首先，在稳态条件下，CRISPR敲除组与对照组细胞的生长速度没有显著差异（补充图S9A–S9D）。图6显示，“AraC反应”转录因子参与获得AraC耐药性。A图为对照组（转染空载体）和CRISPR敲除PU.1的HL60细胞中PU.1的mRNA含量柱状图（左）以及代表性的smFISH图像（右）。横条代表平均值。****表示P<0.0001，通过非参数Mann–Whitney U检验得出。PU.1的转录本呈白色伪彩色，DNA呈蓝色伪彩色。刻度尺为5微米。B图为对照组（转染空载体）和CRISPR敲除GATA1的HL60细胞中GATA1的mRNA含量柱状图（左）以及代表性smFISH图像（右）。横条代表平均值。****表示P<0.0001，通过非参数Mann–Whitney U检验得出。GATA1的转录本呈白色伪彩色，DNA呈蓝色伪彩色。刻度尺为5微米。C图为对照组（转染空载体）和CRISPR敲除HOXA11的HL60细胞中HOXA11的mRNA含量柱状图（左）以及代表性smFISH图像（右）。横条代表平均值。****表示P<0.0001，通过非参数Mann–Whitney U检验得出。HOXA11的转录本呈白色伪彩色，DNA呈蓝色伪彩色。刻度尺为5微米。D图为对照组（转染空载体）和CRISPR敲除LYL1的HL60细胞中LYL1的mRNA含量柱状图（左）以及代表性smFISH图像（右）。横条代表平均值。****表示P<0.0001，通过非参数Mann–Whitney U检验得出。LYL1的转录本呈白色伪彩色，DNA呈蓝色伪彩色。刻度尺为5微米。E图为对照组和PU.1敲除组HL60细胞在经过250纳米摩尔/升AraC处理3天后，处理第14天时对AraC敏感性的变化情况。IC50值的倍数变化是通过将AraC处理过的对照组和PU.1敲除组细胞的IC50值除以未处理对照组的IC50值来计算的（n=4，技术重复样本）。****表示P<0.0001，通过非配对t检验得出。F图为对照组和GATA1敲除组HL60细胞在经过250纳米摩尔/升AraC处理3天后，处理第14天时对AraC敏感性的变化情况。IC50值的倍数变化是通过将AraC处理过的对照组和GATA1敲除组细胞的IC50值除以未处理对照组的IC50值来计算的（n=4，技术重复样本）。***表示P<0.001，通过非配对t检验得出。G图为对照组和PU.1敲除组HL60细胞在经过3天AraC处理后的细胞生长恢复情况。y轴为使用台盼蓝计数所得的存活细胞数量（对数尺度，均值±标准差）（n=3，技术重复样本）。*表示P<0.05，**表示P<0.01，通过非配对t检验得出。H图为对照组和GATA1敲除组HL60细胞在经过3天AraC处理后的细胞生长恢复情况。y轴为使用台盼蓝计数所得的存活细胞数量（对数尺度，均值±标准差）（n=3，技术重复样本）。*表示P<0.05，**表示P<0.01，通过非配对t检验得出。I图为对照组和HOXA11敲除组HL60细胞在经过250纳米摩尔/升AraC处理3天后，处理第14天时对AraC敏感性的变化情况。IC50值的倍数变化是通过将AraC处理过的对照组和HOXA11敲除组细胞的IC50值除以未处理对照组的IC50值来计算的（n=4，技术重复样本）。J图为对照组和HOXA11敲除组HL60细胞在经过3天AraC处理后的细胞生长恢复情况。y轴为使用台盼蓝计数所得的存活细胞数量（对数尺度，均值±标准差）（n=3，技术重复样本）。K图为对照组和LYL1敲除组HL60细胞在经过250纳米摩尔/升AraC处理3天后，处理第14天时对AraC敏感性的变化情况。IC50值的倍数变化是通过将AraC处理过的对照组和LYL1敲除组细胞的IC50值除以未处理对照组的IC50值来计算的（n=4，技术重复样本）。L图为对照组和LYL1敲除组HL60细胞在经过3天AraC处理后的细胞生长恢复情况。y轴为使用台盼蓝计数所得的存活细胞数量（对数尺度，均值±标准差）（n=3，技术重复样本）。EV表示空载体。图6显示，“AraC反应”转录因子参与获得AraC耐药性。A图为对照组（转染空载体）和CRISPR敲除PU.1的HL60细胞中PU.1的mRNA含量柱状图（左）以及代表性smFISH图像（右）。横条代表平均值。****表示P<0.0001，通过非参数Mann–Whitney U检验得出。PU.1的转录本呈白色伪彩色，DNA呈蓝色伪彩色。刻度尺为5微米。B图与A图结构相同，为GATA1的相关数据。C图与A图结构相同，为HOXA11的相关数据。D图与A图结构相同，为LYL1的相关数据。HOXA11转录本以白色伪彩色显示，DNA以蓝色伪彩色显示。比例尺为5微米。D图为每细胞的mRNA计数柱状图（左侧）以及(EV转染的)对照组和CRISPR介导的LYL1基因敲除HL60细胞（LYL1 KO）的代表性smFISH图像（右侧）。横轴表示平均值。****，通过非参数Mann–Whitney U检验，P <0.0001。LYL1转录本以白色伪彩色表示，DNA以蓝色伪彩色表示。比例尺为5微米。E图为处理后14天，对照组和PU.1基因敲除HL60细胞对AraC敏感性的变化情况（在250纳米摩尔/升的AraC处理3天后）。IC50值的倍数变化是通过将经AraC处理的对照组和PU.1基因敲除细胞的IC50值除以未经处理的对照细胞的IC50值来计算的（n = 4；技术重复样本）。****，通过非配对t检验，P <0.0001。F图为处理后14天，对照组和GATA1基因敲除HL60细胞对AraC敏感性的变化情况。IC50值的倍数变化是通过将经AraC处理的对照组和GATA1基因敲除细胞的IC50值除以未经处理的对照细胞的IC50值来计算的（n = 4；技术重复样本）。***，通过非配对t检验，P <0.001。G图为处理后3天，对照组和PU.1基因敲除HL60细胞的细胞生长恢复情况。y轴表示使用台盼蓝计数的存活细胞数量（平均值±标准差），采用对数刻度表示（n = 3；技术重复样本）。*，通过非配对t检验，P <0.05；**，P <0.01。H图为处理后3天，对照组和GATA1基因敲除HL60细胞的细胞生长恢复情况。y轴表示使用台盼蓝计数的存活细胞数量（平均值±标准差），采用对数刻度表示（n = 3；技术重复样本）。*，通过非配对t检验，P <0.05；**，P <0.01。I图为处理后14天，对照组和HOXA11基因敲除HL60细胞对AraC敏感性的变化情况。IC50值的倍数变化是通过将经AraC处理的对照组和经AraC处理的HOXA11基因敲除细胞的IC50值除以未经处理的对照细胞的IC50值来计算的（n = 4；技术重复样本）。J图为处理后3天，对照组和HOXA11基因敲除HL60细胞的细胞生长恢复情况。y轴表示使用台盼蓝计数的存活细胞数量（平均值±标准差），采用对数刻度表示（n = 3；技术重复样本）。K图为处理后14天，对照组和LYL1基因敲除HL60细胞对AraC敏感性的变化情况。IC50值的倍数变化是通过将经AraC处理的对照组和经AraC处理的LYL1基因敲除细胞的IC50值除以未经处理的对照细胞的IC50值来计算的（n = 4；技术重复样本）。L图为处理后3天，对照组和LYL1基因敲除HL60细胞的细胞生长恢复情况。y轴表示使用台盼蓝计数的存活细胞数量（平均值±标准差），采用对数刻度表示（n = 3；技术重复样本）。EV为空载体。关闭模态框

然而，当我们用250纳米摩尔/升的AraC处理对照组以及PU.1或GATA1靶点细胞3天后，在第14天检测其对AraC的敏感性时，发现PU.1或GATA1靶点细胞的IC50值相比对照组有显著降低（分别降低了51%和60%；见图6E和F）。我们还观察到，经过AraC处理后，PU.1和GATA1靶点细胞的细胞增殖受到更明显的抑制，且恢复速度更慢（见图6G和H）。相比之下，HOXA11和LYL1靶点细胞在AraC敏感性及细胞生长动力学方面与对照组相比没有显著差异（见图6I–L）。综合这些数据表明，ARR-TFs的快速转录动态在快速且早期获得AraC抗性中起着重要作用。讨论

在本研究中，我们提供了证据，表明在短期AraC处理后RNA转录动态的快速增加，在AML细胞早期及随后稳定获得AraC抗性过程中起着关键作用。重要的是，通过抑制这种RNA诱导，尤其是针对那些对造血至关重要的主调控因子——即ARR-TFs的mRNA，能够有效阻止体外AraC抗性的产生。这些发现凸显了快速转录动态作为一种非遗传性的适应性分子机制，在AML早期获得化疗抗性中的作用，并提出了一种以恢复白血病及其他癌症中正常的转录动态和调控机制为核心的治疗策略。从历史上看，关于化疗抗性的研究主要集中在识别导致抗性的遗传变异以及现有克隆的达尔文选择机制上（19, 28–32），目前的研究也在探索表观遗传机制，如增强子重塑（33, 34）。然而，大多数这类研究都依赖于通过逐步增加剂量长期暴露于药物而产生的高度化疗抗性细胞，这类细胞往往存在众多遗传异常。相比之下，尤其是在短期药物处理后出现的早期抗性机制仍不太为人所知，现有的研究主要聚焦于新开发的靶向疗法（35, 36）。这一知识空白凸显出有必要进一步研究传统化疗后导致早期抗性的非遗传机制，因为这些机制可能是更长期、更稳定的机制，如遗传变化（37）的前兆。我们的研究表明，在化疗开始后的最初几小时内，快速的适应性转录诱导在获得化疗抗性方面起着重要的替代作用。在我们使用AML细胞系进行的短期暴露实验中，我们未能检测到具有明确遗传特征的亚克隆的出现或选择。我们的数据表明，所观察到的抗性表型在功能上依赖于快速的转录激活，而这种激活可以通过药物进行抑制。未来需要借助先进的谱系追踪技术和活细胞单细胞分析方法，来揭示选择与适应之间的相对贡献；需要注意的是，这两种机制并非相互排斥，很可能都发挥着重要作用。我们观察到，在短期AraC处理后，RNA合成增强的细胞群体比其余细胞具有更强的AraC抗性。由于AraC是一种嘧啶核苷类似物，主要作用于处于增殖期的S期细胞，因此其处理会导致G1期细胞相对增多（38, 39）。值得注意的是，一些经AraC处理的G1期细胞表现出较高的RNA合成水平，这表明它们正处于从G1期向S期过渡并随后增殖的状态——同时，它们对AraC的敏感性也有所降低。传统上，人们认为化疗抗性癌细胞主要源自静止或休眠的非周期细胞（40）。然而，也有研究表明，化疗抗性细胞也可以来自活跃增殖的（非静止的）细胞群（41, 42）。例如，在2天多柔比星处理期间，p21表达处于中间水平和高水平的G1期细胞表现出不同的处理后命运，这表明肿瘤内的转录异质性在决定治疗结果方面起着重要作用（42）。这些观察结果进一步强调了有必要研究转录动态在治疗后短时间内影响药物敏感性的作用，这一特性也可能有助于预测治疗过程中的后续抗性产生。进一步研究转录动态（如PRO-Seq和DRB释放分析）有助于阐明在抗性AML细胞中，具体的转录加工变化是如何以及在哪里发生的，从而确定RNA的丰度。我们还建议采用我们团队开发的一种名为CLICK-CUT&Tag的技术（43），利用化学修饰过的AraC来研究AraC是否与转录组及染色质相互作用，从而以特定细胞环境的方式调节细胞反应。此外，对活细胞中的单分子TF染色质驻留情况进行分析，可以了解AraC引起的TF功能短暂变化。再者，诸如CUT&Tag或针对磷酸化Ser5的RNA Pol II的ChIP技术，结合3D染色质接触分析（如Micro-C），也有助于了解AraC、染色质与转录调控在AML患者体内的精确动态关系。总体而言，我们的研究发现了AraC的一种此前未被描述过的效应，为研究快速适应性化疗抗性机制开辟了新途径，这些机制或许能为靶向治疗干预提供新的策略。鉴于转录可变性对细胞命运决策的深远影响，针对转录动态进行研究具有很大的潜力，有助于揭示发育机制并开发新的治疗策略。例如，在干细胞分化背景下，IdU（一种胸腺嘧啶类似物）已被证明能增加小鼠胚胎干细胞中的转录噪声，从而促进细胞分化和重编程（44, 45）。同样，稳定转录噪声的KAT2A基因的缺失，能增强白血病分化并减少AML小鼠模型中的白血病干细胞数量（13, 46）。此前也有研究报道，经AraC处理的AML细胞会出现转录变化（如与高氧化磷酸化状态相关的特征），不过这些研究是在AraC处理后较长时间点（>1周）通过全面的基因表达分析发现的，而且这些变化似乎至少部分与AraC抗性的获得有关（47–49）。需要指出的是，据我们所知，我们的研究首次提供了证据，表明在AraC处理后1天内就会发生非常快速的转录诱导，同时转录异质性和TF表达也会增加。这种异质性的增加导致了ARR-TFs等基因的等位基因爆发现象，而这种现象可以通过抑制RNA Pol II介导的mRNA合成来加以干预。因此，我们的研究建立了快速适应性化疗抗性与转录异质性之间的直接联系。我们未来的研究计划利用单分子技术和活细胞命运追踪方法，进一步深入探讨这一现象。dBET6是一种强效的mRNA转录抑制剂，它能降解BRD4并阻断RNA Pol II延伸复合物的组装（23）。已有研究报道，它与其他化疗药物联合使用时具有抗肿瘤作用，包括与AraC联用（50）。在本研究中，AraC与dBET6联合使用能引发细胞凋亡作为最终效应。我们的研究表明，提前使用dBET6处理可以防止AML细胞系和患者来源的异种移植模型中出现抗性。在AraC处理之前使用dBET6处理对于抑制导致后续稳定抗性产生的早期RNA诱导至关重要。不过，目前这项研究仍属于临床前概念验证研究，未来还需要在转化医学和临床环境中进一步评估。此外还需要注意的是，由于毒性、治疗窗口狭窄以及药物递送效果不佳等问题，dBET6（23, 24, 51）尚未获得临床应用批准（52）。克服这些挑战的一个潜在策略是开发靶向药物递送系统，比如抗体-药物偶联物，这类系统能够将转录抑制剂（如BET降解剂）精准地递送到癌细胞中，同时最大限度地减少对正常细胞的毒性（53）。为了实现这些目标，还需要进一步研究针对转录动态的疗法以及创新的递送平台，以确保其在临床上的安全有效应用。最后，我们的研究还发现，在AraC处理仅1天后，就有一部分TF的转录活性在特定细胞群中上升，这表明它们作为“AraC响应”TF，在早期抗性形成过程中起着关键作用。尽管失调的TF网络对化疗抗性的影响目前还鲜有研究，但已有研究表明，在多种癌症中，MYC基因的抑制会诱导类似滞育的状态，进而改变细胞的化疗敏感性（54, 55）。有趣的是，在我们的研究中，MYC并未成为AraC响应TF，可能是因为我们主要关注的是处于活跃增殖状态的G1期细胞，而非静止细胞群。随着人们对特定TF的转录动态在调节化疗敏感性中的作用了解得越来越清楚，未来或许也有机会开发出针对这些TF的疗法来预防化疗抗性。尽管在针对TF进行治疗方面总体上还存在诸多挑战，但一些进展——比如已经有了能够调控PU.1转录动态及其转录网络的小分子药物（43）——表明这类方法在原理上是可行的。因此，利用高分辨率技术详细绘制TF动态图谱，并研究其在抗性形成过程中的失调情况，最终有望为AML及其他由异常转录程序驱动的疾病带来新的TF靶向疗法。最后，我们的研究还为未来研究非遗传性化疗抗性中的转录诱导机制及其在其他肿瘤类型中的应用奠定了基础。方法

化合物与细胞

AraC（MedChem，HY-13605）、ActD（Sigma，A9415）、dBET6（MedChem，HY-112588）、CX-5461二盐酸盐（CX5461；MedChem，HY-13323A）以及椭圆菌素（MedChem，HY-15753）均从Sigma或MedChemExpress购买。AraC、ActD、dBET6和椭圆菌素溶解在DMSO中，而CX5461则溶解在水中。HL60（ATCC，CCL-240）、NB4（DSMZ编号）ACC207细胞和MOLM14细胞（DSMZ编号ACC777）最初从ATCC或DSMZ购买，随后在完全培养基中培养[由RPMI 1640培养基（Corning，10-040-CV）加上10%的热灭活胎牛血清（Gemini，900-108）以及1%的青霉素-链霉素混合物（Corning，30-002-CI）组成]。所有细胞均在37°C、5%二氧化碳的环境下的培养箱中培养，且需避免支原体污染。所有关键试剂，包括药物、细胞、抗体及软件，其RRID信息均列于关键资源表中（补充表S1）。

AraC处理
HL60、NB4和MOLM14细胞分别用IC95剂量的AraC处理，其中HL60的剂量为250纳米摩尔/升，而NB4和MOLM14的剂量则为500纳米摩尔/升。短期暴露实验中，单次处理的持续时间为一天；而一些长期实验则持续三天。对照组细胞则用DMSO进行相同时长的处理。处理完成后，细胞先在完全培养基中洗涤，然后再继续培养数天，以便在14天或28天后检测AraC敏感性的变化。对于ATAC-seq实验，会在第0天、第1天以及处理3天后的第14天采集细胞，用于染色质提取与分析。

细胞存活率检测
细胞存活率是通过遵循制造商说明书，使用CellTiter-Blue细胞存活率检测试剂（Promega，G8080）来测定的。具体操作为：将5×103个细胞接种到96孔板中的每个孔内，孔内培养基中含有依次稀释的AraC。将培养板置于37°C、5%二氧化碳环境下培养72小时，之后向每个孔中加入20微升的CellTiter-Blue试剂。再继续培养2小时，随后使用VICTOR X5多标签平板读取器（PerkinElmer）进行读数。通过GraphPad Prism软件（版本8.4.3；GraphPad Software），将数据拟合到“对数（抑制剂浓度）与标准化响应值”的非线性回归模型中，从而确定IC50值。

EU标记新生RNA
新生RNA的合成活性是通过遵循制造商说明书，使用RNA合成检测试剂盒（Abcam，ab228561）来检测的。操作流程为：先将细胞在完全培养基中培养，然后以1毫米摩尔/升的最终浓度加入EU，脉冲处理1小时，之后用固定液固定15分钟。固定完成后，用通透化缓冲液处理细胞10分钟，再用Wash Buffer IV洗涤。接着将样本在黑暗中的室温下与点击反应混合液共同孵育30分钟。之后倒掉反应混合液，再次用Wash Buffer IV洗涤样本，随后用1×PBS洗涤。最后用DAPI（Millipore，10236276001）对样本进行染色，并使用FACSymphony A5流式细胞仪（BD Biosciences）进行分析。流式细胞数据则通过FACSDiva和FlowJo软件（BD Biosciences）进行处理。

Pyronin Y检测RNA与细胞周期
如先前所述（56），可通过使用pyronin Y（Sigma，P9172）和Hoechst 33342（Invitrogen，H3570）在活细胞中进行细胞周期检测，以此测定RNA表达水平。具体操作为：首先将细胞在新鲜配制的Hoechst染色培养基（RPMI 1640 + 10% FBS + PS + 20毫摩尔/升HEPES + 50微克/毫升维拉帕米）中，于37°C下用Hoechst 33342（10微克/毫升）染色45分钟；之后加入pyronin Y（5微克/毫升），继续染色15分钟。随后将细胞洗涤一次，再用FACSymphony A5流式细胞仪进行分析，或者使用FACSAria III细胞分选仪（BD Biosciences）将细胞分为处于G0–G1细胞周期阶段的PYHigh组和PYLow组。

SYTO RNASelect染料检测RNA表达
按照制造商的说明，可在活细胞中结合Hoechst，使用SYTO RNASelect染料（Invitrogen，S32703）来检测总RNA的表达水平。操作流程为：首先将细胞在细胞培养基中用Hoechst 33342（10微克/毫升）在37°C下染色45分钟，之后加入10毫摩尔/升的SYTO RNASelect染料，继续染色30分钟。随后用1×PBS洗涤细胞一次，再用FACSymphony A5流式细胞仪进行分析。

全基因组测序
进行全基因组测序时，首先使用QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN，51304）提取基因组DNA。随后用NanoDrop 2000光谱仪（Thermo Fisher Scientific）检测所提取DNA的数量与质量。文库构建与测序工作则由Novogene Co., Ltd.负责。具体而言，首先使用Agilent SureSelect Human All Exon Kit V6（Agilent Technologies，5190-8864）构建测序文库，之后利用这些构建好的DNA文库，在Illumina NovaSeq平台上进行150碱基对的配对端测序。未经过处理的细胞被用作对照组。首先使用FastQC（版本0.12.1）检测原始测序读段（FASTQ文件）的质量。接着使用Cutadapt（版本3.5）去除适配器序列以及低质量碱基，具体去除规则为：删除Illumina适配器序列AGATCGGAAGAGC，要求读段长度至少为30碱基对，质量阈值设定为Q20，同时去除末端的模糊碱基。经过修剪后的读段再使用BWA-MEM（版本0.7.17）与人类参考基因组（GRCh38初级组装版）进行比对。使用GATK MarkDuplicates（版本4.6.2）标记PCR重复序列。对于小变异的检测，使用GATK（版本4.6.2）识别SNV和小型插入缺失变异。针对每个样本，使用HaplotypeCaller的GVCF模式进行变异调用。随后使用CombineGVCFs合并各个单独的GVCF文件，再通过GenotypeGVCFs进行联合基因分型，从而生成多样本的VCF文件。结构变异则是通过Manta（版本1.6.0）来识别。以去重后的BAM文件作为输入，以GRCh38参考基因组为依据进行结构变异检测。SNV的检测使用MuTect（57），而插入缺失变异则通过Strelka（58）来识别。所检测到的SNV和插入缺失变异信息汇总在补充表S2中。

qRT-PCR与RNA-Seq
首先使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN，74004）从细胞中提取RNA。进行qRT-PCR时，使用SuperScript II逆转录酶（Bio-Rad，1708890）对1微克的RNA进行逆转录。PCR反应在ViiA7仪器上进行，所用试剂为Power SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher，4368577）。表达水平以GAPDH作为参照标准，所用引物信息列于补充表S3中。对于mRNA-seq实验，文库构建与转录组测序同样由Novogene Co., Ltd.负责。操作流程为：先分别使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher）和Bioanalyzer（Agilent Technologies）检测RNA的数量与质量。随后取对照组及经AraC处理的细胞，或是PYHigh组与PYLow组各400纳克的总RNA，利用带有poly T寡核苷酸的磁珠进行富集处理，再将RNA切割并逆转录成cDNA。每个样本制备三个技术重复组，用于后续的cDNA文库构建。这些cDNA文库在Illumina NovaSeq平台上进行测序，从而获得配对端读段。同样，首先使用FastQC（版本0.12.1）检测原始测序读段的质量。之后使用Cutadapt（版本3.5）去除适配器序列及低质量碱基，去除规则与前述相同，即删除Illumina适配器序列AGATCGGAAGAGC，要求读段长度至少为30碱基对，质量阈值设定为Q20，同时去除末端的模糊碱基。经过修剪后的读段再使用STAR（版本2.7.10a）以两遍比对模式与人类参考基因组（GRCh38初级组装版）进行比对，以此提高剪接位点的检测精度。比对结果以坐标排序后的BAM文件形式保存。使用featureCounts（Subread版本2.0.1）以及相应的GTF文件注释（例如GENCODE版本44）来计算基因水平的表达量。featureCounts以配对端模式运行，且链特异性设置为反向链。差异基因表达分析则是在R语言（版本4.4.2）中借助DESeq2（版本1.46.0）来完成。将原始计数矩阵导入DESeq2后，通过中位数比值法对其进行归一化处理，以此弥补测序深度和RNA组成差异带来的影响。差异表达值则是基于DESeq2中实现的负二项广义线性模型框架计算得出的。

基因集富集分析
基因集富集分析是在R语言中借助fgsea包（版本1.32.4）来进行的。首先根据DESeq2的差异表达结果，按照log2倍变化值对基因进行排序。基因集则是通过msigdbr包（版本25.1.1）从MSigDB数据库中获取的。分析时采用归一化的富集分数来进行预排序，那些调整后的P值（Benjamini–Hochberg检验）小于0.1的通路被视为具有显著性。所使用的基因集信息列于补充表S4中。

单细胞RNA测序
单细胞RNA测序文库是使用10x Genomics Chromium Single Cell 3′版本3平台构建的。测序数据则通过Cell Ranger（版本7.0.1）进行处理，所用的人类参考转录组数据为GRCh38-3.0.0版本（refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0）。在对数据进行比对和定量分析时，会将内含子序列也包含在内。在完成质量过滤后——即每个细胞内的基因数量要在500到7,000之间，线粒体相关读段的比例要低于20%——就会提取每个细胞内的基因数量以及唯一分子标识符的数量，并对比PY-high组与PY-low组之间的差异。

ATAC-Seq
首先使用FastQC（版本0.12.1）检测原始测序读段（FASTQ文件）的质量。之后使用Cutadapt（版本3.5）去除适配器序列及低质量碱基，去除规则为：删除Nextera转座酶序列CTGTCTCTTATACACATCT，要求读段长度至少为30碱基对，质量阈值设定为Q20，同时去除末端的模糊碱基。将配对端读段使用Bowtie2（版本2.2.5）以非常敏感的预设参数与人类参考基因组（GRCh38）进行比对，设置最大片段长度为2,000碱基对（?X 2000），同时禁用不一致比对和混合比对。之后使用SAMtools将比对结果转换为BAM格式。再用SAMtools去除线粒体相关读段，同时使用Picard MarkDuplicates工具去除PCR重复序列。在每个处理步骤之后，都会对BAM文件进行索引处理。为纠正Tn5转座酶的插入偏差，需要将读段的起始位置进行移动——正向链读段移动4碱基对，负向链读段移动5碱基对。只有那些调整后的坐标值大于等于1的读段才会被保留下来。经过移动后的BAM文件会再次使用SAMtools进行排序和索引。随后使用MACS2工具以配对端模式进行峰检测，同时设置人类基因组大小参数（–g hs），启用重复序列保留功能，并开启峰点检测功能（–call-summits）。在单个样本中识别出的峰点（MACS2 narrowPeak文件）会通过BEDTools工具进行拼接和合并，从而生成一个共识峰集。这些峰点的中心位置会被调整，并向外扩展±250碱基对，形成宽度为500碱基对的固定区域。为了避免重复，这些重叠的区域会被重新合并。那些与ENCODE hg38黑名单中的基因位点重叠的区域，会通过BEDTools intersect工具被移除。最终筛选得到的峰集会被排序，作为共识参考序列。使用BEDTools的coverage功能在排序模式下计算每个峰点的读段数量，同时提供基因组大小信息（–g hg38.genome）。还会提取每个区域的原始片段计数，以便后续进行归一化处理以及差异可及性分析。所有样本的共识峰点的原始片段计数会被整合成一个计数矩阵。这些峰点会通过基因组坐标进行标注，随后在R语言中借助DESeq2工具进行差异可及性分析。在分析之前，那些在所有样本中的总计数低于10的峰点会被剔除。

smFISH技术
为设计用于顺序smFISH的mRNA特异性探针，首先使用每个基因的全长转录本作为输入，通过PaintSHOP工具（https://paintshop.io/；参考文献59）获取10到29个初始靶向序列，这些序列的长度在23到39碱基对之间，且相邻序列之间至少相隔10碱基对。随后使用NCBI Blast工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对这些候选序列进行检测，以排查是否存在脱靶效应。之后将选中的序列在5′端和3′端进行连接，同时在序列的两侧添加相同的20碱基对序列作为标记——即RO-1：ATACTGGAGCGACGCGTGAT，RO-2：GTTTGAAGATTCGACCTGGA，RO-4：CTAAGGTACCTAATTGCCTAG，或者RO-6：GTACCGTAGGATCTGATGAA——从而生成最终的“初始探针”（见补充表S5）。smFISH免疫荧光染色及其分析方法与先前描述的一致（9, 43）。具体操作为：先将未经处理的对照组细胞，以及经AraC处理的HL60细胞（浓度为250微摩尔/升，处理时间为1天）或NB4细胞（浓度为500微摩尔/升，处理时间为1天），用聚-L-赖氨酸涂层（Sigma-Aldrich）固定在盖玻片上。用PBS冲洗掉残留的培养基，然后将细胞在含有1毫米摩尔/升MgCl2的PBSM溶液中的3.2%多聚甲醛（PFA；Electron Microscopy Sciences）中于室温下固定10分钟。之后将细胞在含有0.1% Triton X-100的PBSM溶液中渗透处理10分钟。再用PBSM冲洗细胞后，将其在含有30%预杂交缓冲液[30%甲酰胺、2×盐水-柠檬酸钠缓冲液（SSC）]的溶液中于室温下孵育10分钟。初次杂交则在含有10%硫酸葡聚糖、30%甲酰胺、2×SSC、2毫摩尔/升钒核糖核苷复合物（VRC）、10毫克/毫升鲑鱼精子的剪切单链DNA、10毫克/毫升大肠杆菌tRNA、10毫克/毫升分子级牛血清白蛋白以及100纳克初始探针混合物的30%杂交缓冲液中进行，反应时间为过夜，温度为37°C。之后将细胞在30%预杂交缓冲液中再次洗涤两次，每次15分钟，温度仍为37°C，然后再用2×SSC洗涤两次。随后将细胞在含有3.2% PFA的PBSM溶液中过夜固定，之后再用2×SSC洗涤。原始染色细胞在37°C下与10%预杂交缓冲液（10%甲酰胺，2×SSC）共同孵育10分钟，之后用含10%右旋糖酐硫酸盐、10%甲酰胺、2×SSC、2 mmol/L的VRC、10 mg/mL的鲑鱼精子剪切ssDNA、10 mg/mL的大肠杆菌tRNA、10 mg/mL的BSA以及针对每个基因的10 ng的Cy3-、Cy5-、AF488-或AF594偶联的“二级检测探针”（见补充表S5）在37°C下孵育4小时。随后将细胞在10%预杂交缓冲液中洗涤两次，每次10分钟，最后在2×SSC中洗涤一次。接着将细胞置于ProLong Diamond抗褪色试剂以及4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Invitrogen，P36935）中固定。图像是通过徕卡Thunder荧光显微镜（徕卡）或尼康Ti2-E荧光显微镜（尼康）上的油浸式100倍物镜拍摄得到的。Cy3、Cy5、AF488、AF594和DAPI的曝光时间分别为250、300、250、300和10毫秒。通过沿z轴每隔300纳米拍摄一次图像，获得了覆盖细胞整个体积的Z轴堆叠图像。在数据分析方面，利用基于MATLAB编写的免费软件FISH-quant（60），通过对阈值化后的斑点进行3D高斯拟合来进行单分子mRNA和TS检测，该软件为MATLAB R2021a版本。在每项实验中，对三个生物学重复组进行了smFISH检测。将这些独立实验的数据汇总后，通过Mann–Whitney U检验来判断每个细胞上平均值的真实变化是否具有统计学显著性。

t-SNE分析

使用MATLAB中的“tsne”函数对多重smFISH数据进行了t-SNE分析。从不同荧光染料（PU.1用Cy3、GATA1用AF594、RUNX1用Cy5）同时获得的smFISH数据集中提取了PU.1、GATA1和RUNX1的表达水平，作为t-SNE分析的输入数据。这些数据在困惑度为20的情况下被降维到二维空间。得到的t-SNE坐标与原始数据集结合后，通过散点图进行可视化展示。

CRISPR-Cas9介导的转录因子基因敲除细胞的构建

如前文所述（61），使用CRISPR-Cas9技术进行了基因编辑。简而言之，利用生物信息学工具CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/；参考文献62）设计了三种针对PU.1、GATA1、HOXA11和LYL1的特异性寡核苷酸，然后将它们插入到CRISPR-Cas9基因编辑载体[pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)，质粒编号：48138；Addgene]中。这些特异性载体通过核转染系统（Lonza）被转染到HL60细胞中。经过GFP筛选以减少稀释效应以及基因型检测（见补充表S3）后，建立了每种转录因子的亚系。这些亚系通过RT-qPCR（见补充表S3）和smFISH进行筛选。对照亚系则是使用不含特异性寡核苷酸的载体按照相同流程建立的。

AraC处理后细胞生长恢复情况的监测

为了评估AraC处理后细胞生长恢复动态的差异，将CRISPR-Cas9介导的转录因子基因敲除细胞和对照细胞以三重重复的形式接种到24孔板中的1 mL完全培养基（含10% FBS和1% PenStrep的RPMI-1640培养基）中，每孔30,000个细胞。两种类型的细胞均被用250 nmol/L的AraC处理3天。撤去AraC后，细胞在无AraC的培养基中继续培养，第6、8、10和12天时每孔中的细胞数量保持一致。在第3、6、8、10、12和14天，通过使用含有台盼蓝（Thermo Fisher，15250061）染色的血细胞计数板来统计存活细胞数，从而监测细胞生长情况。

小鼠

NSG小鼠购自The Jackson Laboratory（编号#005557）。这些小鼠在我们的动物实验设施中于无特定病原体条件下饲养，所有实验均获得了阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物护理与使用委员会的批准（实验方案编号0000-1099）。

小鼠皮下肿瘤模型

对于皮下移植实验，将HL60细胞和NB4细胞分别稀释至5 × 10^6和1 × 10^7个细胞/毫升的浓度，清洗后悬浮在PBS中，然后在冰上与75 μL的Matrigel（Corning，CLS356234-1EA）以1:1的比例混合。将150 μL的细胞悬液注射到未经辐射处理的NSG小鼠的剃毛后的皮下腹部。肿瘤生长4天后，开始通过皮下注射直接向肿瘤中给予dBET6（HL60为150 μg/肿瘤/天，NB4为50 μg/肿瘤/天，持续1–6天）、AraC（HL60为2 mg/肿瘤/天，NB4为3 mg/肿瘤/天，持续4–6天），或者同时给予这两种物质（每种处理条件下各有7–8只小鼠）。每隔2天使用数字卡尺测量肿瘤在皮肤表面的最长直径（l）、最短直径（s）和高度（h），从而计算肿瘤体积（公式为l × s × h × 0.52；参考文献63），直到肿瘤体积达到动物护理与使用委员会规定的限制值。这些小鼠最终通过CO2窒息法处死，随后进行颈椎脱位处理。为了分析肿瘤细胞，将在第6天切除肿瘤，并对其进行流式细胞术分析，以检测RNA表达情况。在流式细胞术分析中，肿瘤细胞被染上吡罗宁Y（#P9172，Sigma）、Hoechst 33342（#H3570，Invitrogen）以及用于排除小鼠细胞的人类CD45 APC-Cy7抗体（#304014，BioLegend）。

原发性AML样本

本研究遵循《赫尔辛基宣言》的伦理标准进行。在获得书面知情同意并经过阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构审查委员会的批准（批准号2005-536）后，从12名患者身上获取了成人的AML外周血白细胞分离样本或骨髓穿刺样本。在这项小型探索性研究中，原始样本是根据可用性随机选取的，没有设置排除或纳入标准。用于实验的原发性AML样本的临床特征列在补充表S6中。在流式细胞术分析中，将100万到200万个细胞解冻后，置于1 mL的StemSpan SFEM II培养基（StemCell Tech，09605）中，再加入1× CC100生长培养液（StemCell Tech，02690）以及50 ng/mL的TPO（R&D Systems，288-TPN），过夜培养。次日，这些细胞在存在AraC（1 μmol/L）或DMSO的条件下培养1天。培养结束后，细胞被染上吡罗宁Y（Sigma，P9172）和Hoechst 33342（Invitrogen，H3570），同时还使用以下抗体：谱系标记用的FITC染色抗体（CD3/14/16/19/20/56，BioLegend，348801，稀释比例为1:50）、CD235a FITC抗体（BD Biosciences，559943，稀释比例为1:50）以及CD34 PE抗体（BD Biosciences，555824，稀释比例为1:50），所有染色均在含2% FBS的1× PBS缓冲液中进行。通过设定谱系阳性、CD235a阴性且CD34阳性的筛选条件，来识别原发性AML样本中的造血干细胞（见补充图S8）。流式细胞术分析是在BD FACSymphony A5上进行的，而细胞分选则是在BD FACS Aria II上完成的。在smFISH实验中，未经过处理的以及经过AraC处理的原发性AML细胞中的造血干细胞被固定在涂有10 μg/mL抗CD44生物素（BioLegend，103004，稀释比例为1:1,000；参考文献64）的盖玻片上，而非聚-L-赖氨酸表面。smFISH染色操作按照前述方法进行。

统计分析

数据以条形图的形式呈现，显示平均值和标准差；而对于单细胞RNA测序数据，则以小提琴图的形式展示。n表示技术重复次数或分析过的细胞总数，具体说明见各图的图例。组间比较采用非配对t检验、Mann–Whitney U非参数检验或Wilcoxon秩和检验（针对单细胞RNA测序数据）。所有实验至少进行两次或三次技术重复。当P值小于0.05时，表明两组之间存在显著差异；P值大于0.05则视为无显著差异。所有的流式细胞术数据都是通过FlowJo软件进行分析的。

数据可用性

WES、批量RNA测序、单细胞RNA测序以及ATAC测序的原始序列数据均存储在NCBI基因表达数据库（ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，对应的访问编号分别为PRJNA1433834、GSE324057、GSE324170和GSE324058。

作者利益披露

G. Tatsumi在研究过程中获得了日本学术振兴会海外研究奖学金的资助。A. Verma则获得了布里斯托尔·迈尔斯·斯奎布公司、詹森制药、MedPacto、Curis、Prelude、Halia和Ryvu公司的研究经费支持；同时还因担任Stelexis BioSciences、Halia、Calico和Aurigene公司的科学顾问而获得报酬；此外，他还持有Roshon、Stelexis和clinStreet公司的股权。U. Steidl在研究期间获得了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所以及V基金会的资助，同时还拥有Stelexis BioSciences公司的股份，以及在本研究之外持有的Roshon Therapeutics公司的股权。其他作者则没有报告任何利益冲突。

作者贡献

G. Tatsumi：概念设计、正式分析、研究实施、方法设计、初稿撰写。R. Kumari：正式分析、研究实施、方法设计、文章修订与润色。Y. Suzuki：研究实施。S. Li：正式分析、研究实施。R. Scharf：正式分析、研究实施。S.J. Taylor：研究实施。S. Sundaravel：研究实施。A. Verma：资源提供、实验监督。J.C. Wheat：正式分析、方法设计。U. Steidl：概念设计、资源提供、数据整理、实验监督、资金筹集、文章修订与润色。

致谢

我们感谢爱因斯坦分析成像实验室（NIH P30CA013330）、流式细胞术核心实验室，以及鲁思·L.和戴维·S.戈特斯曼干细胞研究与再生医学研究所的干细胞分离与异种移植核心实验室（该实验室由NYSTEM项目资助，项目编号为C029154）在实验过程中所提供的专业服务与支持。这项工作还得到了美国国立卫生研究院R35CA253127项目的资助，以及V基金会AST2025-007项目的资助（该资助授予U. Steidl）。G. Tatsumi还获得了日本学术振兴会的海外研究奖学金支持。R. Kumari则得到了Blood Cancer United组织的职业发展奖学金支持。S.J. Taylor获得了爱德华·P.埃文斯基金会的青年研究员奖资助。S. Sundaravel则获得了美国国家癌症研究所（K00CA223044项目）以及Blood Cancer United组织（3439-25项目）的资助。U. Steidl目前担任阿尔伯特·爱因斯坦医学院的“爱德华·P.埃文斯骨髓增生异常综合征讲席教授”，该讲席职位是由爱德华·P.埃文斯基金会提供的资助支持的。此外，这项工作还得到了Jane A.和Myles P. Dempsey夫妇的资助。注意：本文的补充数据可在《血液癌症发现》在线平台（https://bloodcancerdiscov.aacrjournals.org/）上查看。