B细胞发育与急性淋巴细胞白血病中的3D染色体重塑

《Blood Cancer Discovery》：3D Chromosome Remodeling in B-cell Development and Acute Lymphoblastic Leukemia

　　开放型图像查看器在健康B细胞前体细胞分化过程中，为研究3D染色体重排现象，我们对所有被分析的前体细胞进行了成对区域转换分析以及差异性TAD活性分析（见补充表S2）。比较结果显示，在整个分化过程中，超过97%的基因组区域（平均每个40 kb窗口下共有63,419个区域）保持稳定，仅在每对比较中平均有1.13%（约700个区域）发生从A区到B区的转换，另有1.57%（约1,000个区域）发生从B区到A区的转换。在连续发育阶段之间比较时，仅有2%到4%的共有TAD显示出差异性活性，而当将CLP细胞与未成熟B细胞相比时，近15%的TAD存在此类差异。总体而言，随着细胞分化程度增加，染色质活性逐渐增强，即B区到A区的转换增多，TAD活性变化也更为显著（见图1C）。我们的数据表明，随着细胞分化，3D染色体结构会逐渐发生变化，其中分化程度相差最远的两个阶段——CLP细胞与未成熟细胞之间的差异最为明显。我们还发现3D结构变化与基因表达变化之间存在显著的整体相关性（见补充图S2E–S2G）。在所有正常B细胞前体细胞样本中表达变化最大的100个基因中，有17个基因在分化过程中会发生区域转换（见图1B）。有趣的是，那些发生区域转换且伴随基因表达变化的基因在造血过程中起着关键作用，其中包括MEIS1——这是一种对正常造血及白血病造血过程至关重要的调控因子。MEIS1在造血干细胞中高度表达，其转录起始点下游140 kb处存在一个保守的调控元件（参考文献35–38）。在本研究中，我们发现MEIS1基因及其调控元件在CLP细胞和前B细胞中位于A区，而在前B细胞和未成熟B细胞阶段则转移到B区，这一变化与TAD结构的逐渐消失相吻合（见图1D和E）。我们利用公开的人类骨髓单核细胞单细胞ATAC-seq数据，通过将CLP、前B细胞和前前B细胞中的细胞按类型聚类，生成了伪批量ATAC-seq数据（参考文献39）。这些伪批量数据进一步反映了该保守调控元件的可及性逐渐降低的情况（见图1D底部），这一趋势与基因表达的逐渐下降一致（见图1F）。相反，在B细胞定向分化过程中，KLHL14基因位点出现了从B区到A区的转换，同时该基因的可及性上升（见补充图S2H）。KLHL14表达水平的升高与TAD活性增加以及与附近增强子的环化作用相关（见补充图S2H和S2I）。KLHL14在成熟B细胞恶性肿瘤中经常发生突变，它可与Cullin-RING泛素连接酶形成复合物，进而对B细胞受体成分的未成熟糖基化形式进行泛素化处理，从而调控BCR信号传导（参考文献40、41）。我们发现，控制B细胞身份的关键调控因子PAX5在前B细胞阶段获得了更高的TAD活性并表现出更高的表达水平（见图1G–I；补充图S2J）。与已定向分化的B细胞前体细胞相比，CLP细胞中该基因的启动子区域可及性有所提升。另有研究指出，PAX5在B细胞早期和晚期的发育过程中都起着调控染色体结构的作用（参考文献11、15、42）。在比较未成熟细胞与CLP细胞时，我们发现参与B细胞信号传导的基因，如CD79A和IGK，以及与其他B细胞分化相关的转录因子，如BACH2、TCL1A和TCL1B，其TAD活性均有所上升（见图1G）。为了解明3D基因组重排所调控的通路，我们对那些在3D结构变化的同时伴有显著且一致的基因表达变化的基因进行了基因本体论分析。在区域转换过程中，与细胞黏附以及细胞群落和增殖调控相关的基因最为常见；而在TAD变化过程中，与适应性免疫系统及免疫球蛋白生成相关的基因则更为突出（见图1J）。黏附分子能够介导造血细胞与骨髓基质及微环境之间的相互作用，这种相互作用对造血前体细胞的分化和增殖具有重要影响。例如ANGPT1就是这样一种黏附分子，它在造血干细胞中高度表达，对于维持这些细胞在骨髓微环境中的静息状态至关重要（参考文献43）。我们发现，随着细胞向B细胞谱系的进一步分化，ANGPT1基因位点逐渐从A区转换为B区，其可及性降低，表达水平也随之下降（见补充图S2K和S2L）。综上所述，这些数据表明，干细胞自我更新以及B细胞分化过程中的关键基因都受到早期B细胞发育阶段基因组结构变化的调控。

在明确了正常人类B细胞前体细胞分化过程中染色体拓扑结构的动态变化之后，我们进一步研究了与B-ALL转化相关的3D结构变化在不同B-ALL亚型中的表现。本研究中对24名新诊断（治疗前）的儿童B-ALL患者以及1名早期复发的儿童患者的分类B-ALL原始细胞进行了RNA-seq分析，这些患者包括7例ETV6::RUNX1型、5例KMT2Ar型（其中4例为KMT2A::AFF1型，1例为KMT2A::MLLT10型）、3例BCR::ABL1+型（费城染色体阳性型）以及3例BCR::ABL1类似型（费城染色体类似型）B-ALL病例。其余7例患者则被归类为21号染色体的染色体内扩增型（iAMP21型，共2例）、超二倍体型（HD型，共1例），或是其他未明确亚型的病例（OTH型，共4例）。我们还对其中的21个样本进行了匹配的原位Hi-C分析，同时对6个样本进行了ATAC-seq分析（见补充表S1和S3）。首先，我们将RNA-seq数据与Hi-C数据整合起来，检测患者群体中的突变和单核苷酸变异，以排除它们可能导致的我们观察到的染色体结构变化。通过Seq-N-Slide平台上的GATK单倍型分析工具（RRID：SCR_021752），我们发现了多个在RAS信号通路相关基因中富集的共有突变，包括NRAS、KRAS和PTPN11基因的突变（见补充图S3A）。随后，我们使用Hi-C breakfinder工具对B-ALL患者样本的临床诊断结果进行了验证，并利用NeoLoop工具可视化染色体重排现象（见补充图S3B–S3D；参考文献44、45）。我们确认从核型分析中确实检测到了KMT2A::AFF1、BCR::ABL1、ETV6::RUNX1以及IKZF1::FBXW11这几种融合基因的存在（见补充图S3C和S3D）。在4例被归类为OTH型的样本中，有2例存在PAX5基因位点的染色体重排现象（见补充图S3B）。除了这些亚型特异性的染色体重排之外，我们还发现了CDKN2A和CDKN2B基因的重复缺失现象，这类缺失在2例KMT2Ar型样本中也有出现（见补充图S3B和S3E）。尽管单核苷酸变异会改变远端基因组区域之间的相互作用频率，导致Hi-C矩阵中出现不连续的信号，但我们发现那些发生基因组重排的基因与因缺失或染色体重排而产生的基因之间几乎没有重叠现象（见补充图S3F和S3G）。我们对按前体细胞类型或B-ALL亚型分类的所有Hi-C接触矩阵进行了皮尔逊相关性分析（见图2A）。分析结果表明所有样本之间的相关性都非常高，这说明无论是在细胞分化过程还是向恶性转化的过程中，基因组结构都保持着高度的保守性。为确定不同B-ALL亚型的起源分化阶段，我们将正常的B细胞前体细胞Hi-C数据集与B-ALL患者的Hi-C数据集结合起来，对40 kb分辨率下的区域划分数据进行PCA分析（见图2B）。PCA分析将ETV6::RUNX1型和KMT2Ar型的B-ALL病例分成了不同的组别。同样地，对表达差异最大的1,000个基因进行PCA分析后，我们也发现了正常细胞样本与恶性细胞样本之间的明显分组（见图2C）。其中PC1主要用于区分正常细胞样本与恶性细胞样本，而PC2则能同时区分细胞的发育阶段以及不同的B-ALL亚型。从转录水平来看，KMT2Ar型B-ALL样本在PC2上与CLP细胞和前B细胞样本聚集在一起，而ETV6::RUNX1型B-ALL样本则与未成熟B细胞和前前B细胞样本聚集在同一组。相比之下，BCR::ABL1型、BCR::ABL1类似型、超二倍体型以及其他类型的B-ALL样本则混合分布在KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型B-ALL样本之间。尽管在健康供体#2的细胞中存在BCR::ABL1融合基因（对应CLP002、PreB002和ProB002样本），但该供体的前体细胞在PC1上仍然与其它正常前体细胞聚集在一起，与Ph+型B-ALL样本分开（见图2C）。图2. 查看大图/下载幻灯片。原位Hi-C分析可识别出与B-ALL转化相关的染色体结构变化。A，以40 kb分辨率对分类后的正常B细胞前体细胞类型与不同B-ALL亚型的Hi-C接触矩阵进行皮尔逊相关性分析。B，对正常B细胞前体细胞（共11个细胞群，来自3个生物样本：001、002和003）以及B-ALL患者样本（共21个个体样本）的区域划分得分进行PCA分析，结果发现B-ALL样本可分为三组。C，对正常供体RNA-seq数据集（共15个细胞群，来自4个生物样本：001、002、003和004）以及B-ALL患者样本（共25个个体样本）中表达差异最大的1,000个基因进行PCA分析，结果同样发现了三个不同的B-ALL样本组别。D，显示对PC1有贡献的前200个基因以及对PC2有贡献的前200个基因的基因表达热图。该热图展示了经过TPM标准化后的读数计数的z值——这是一种标准化分数，用来表示某个样本的基因表达值与所有样本平均值的标准差倍数。E，显示正常B细胞前体细胞与B-ALL患者样本中在40 kb分辨率下发生区域转换且表达最活跃的基因的c-score热图。这些c-score值是使用CscoreTool算法，结合Hi-C-bench工具在40 kb分辨率下确定的，用于将细胞区域划分为活跃区（A区）和非活跃区（B区）。两者之间的差异是通过相对增量来计算的，公式为[delta = (Y ? X)/abs(Y)]，其中X表示参考样本（样本1）中的区域得分，Y表示另一样本（样本2）中的区域得分。F，展示ETV6::RUNX1型（共5例）、OTH型（共4例）、Ph+/Ph类似型（共5例）以及KMT2Ar型（共5例）B-ALL患者样本中MEIS1基因位点（位于chr2:66760000-66800000区间）周围的Hi-C相互作用图。下图显示了具有代表性的ATAC-seq数据轨迹，y轴标注了患者样本。G图展示了MEIS1基因位点处差异最大的40 kb区间组分评分（如E部分所述）。H图通过RNA-seq检测了KMT2Ar（n=5）、Ph+/Ph-like（n=5）、OTH（n=4）以及ETV6::RUNX1（n=7）样本中MEIS1的表达情况。对于G图和H图，均采用Kruskal–Wallis检验来判断差异显著性。“n”表示所有实验组中的生物学重复样本数量。ETV指ETV6::RUNX1；HD为超二倍体；iAMP21指21号染色体的染色体内扩增；PH-Like指类似BCR::ABL1的类型；PH+指BCR::ABL1阳性；TPM指每百万转录本数。

图2. 查看大图 下载幻灯片 原位Hi-C分析可识别与细胞转化相关的染色体结构变化。A图为按40 kb分辨率分组的B细胞（经过分类的健康前体细胞类型）与B-ALL亚型之间的Hi-C接触矩阵的皮尔逊相关性分析结果。B图为健康前体细胞（来自3个生物学样本的11个群体：001、002、003）与B-ALL样本（21个个体患者样本）的组分评分进行主成分分析，结果将B-ALL样本分为三组。C图为对健康供体RNA-seq数据集（来自4个生物学样本的15个群体：001、002、003、004）与B-ALL样本（25个个体患者样本）中差异表达最显著的1,000个基因进行主成分分析，同样识别出三个不同的B-ALL群体。D图为对构成PC1的Top 200个基因以及构成PC2的Top 200个基因的表达热图，热图显示的是经TPM标准化后的读数计数的z分数——这是一种标准化得分，表示某样本的基因表达值与所有样本平均值的标准差倍数。E图为在40 kb区间内，正常B细胞前体细胞与B-ALL细胞中c评分的变化情况，以及这些细胞群中表达最活跃的基因。c评分是通过CscoreTool算法，利用40 kb区间的Hi-C-bench数据来判定活跃（A）与非活跃（B）区域。差异值通过相对增量计算[delta = (Y ? X)/abs(Y)，其中X为参考样本1的区间评分，Y为样本2的区间评分]。F图为ETV6::RUNX1（n=5）、OTH（n=4）、Ph+/Ph-like（n=5）以及KMT2Ar（n=5）型B-ALL样本中MEIS1基因位点（chr2:66760000-66800000）周围的Hi-C相互作用图。下图展示了具有代表性的ATAC-seq数据轨迹，y轴标注了患者样本。G图展示了MEIS1基因位点处差异最大的40 kb区间组分评分（如E部分所述）。H图通过RNA-seq检测了KMT2Ar（n=5）、Ph+/Ph-like（n=5）、OTH（n=4）以及ETV6::RUNX1（n=7）样本中MEIS1的表达情况。对于G图和H图，均采用Kruskal–Wallis检验来判断差异显著性。I图为健康B细胞前体细胞中EPHA7基因位点（chr6:92600000-94200000）周围的Hi-C相互作用图，以及ETV6::RUNX1（n=5）、OTH（n=4）、Ph+/Ph-like（n=5）和KMT2Ar（n=5）型B-ALL样本中的相应情况。EPHA7基因序列区域由黑色箭头标出。J图展示了EPHA7基因位点（chr6:93920000-93960000）处差异最大的组分评分（如E部分所述）。K图通过RNA-seq检测了KMT2Ar（n=5）、Ph/Ph-like（n=5）、OTH（n=4）以及ETV6::RUNX1（n=7）样本中EPHA7的表达情况。对于J图和K图，均采用Kruskal–Wallis检验来判断差异显著性。“n”表示所有实验组中的生物学重复样本数量。ETV指ETV6::RUNX1；HD为超二倍体；iAMP21指21号染色体的染色体内扩增；PH-Like指类似BCR::ABL1的类型；PH+指BCR::ABL1阳性；TPM指每百万转录本数。

B-ALL中与细胞转化相关的动态3D染色体重排

为更好地了解B-ALL亚型的异质性，并对比它们与正常前体细胞的差异，我们分析了构成PC1的200个基因以及构成PC2的200个基因的转录特征。研究发现，ETV6::RUNX1型和KMT2Ar型B-ALL具有最独特的转录特征，而其他所有亚型（BCR::ABL1/-样型、HD型、iAMP21型以及OTH型）则与ETV6::RUNX1型和KMT2Ar型存在一些共同的转录变化（见图2D）。在所有研究样本中动态表达的400个基因中，近25%的基因也具有不同的区域状态，其中包括MME基因和MEIS1基因（见图2E）。MEIS1基因与HOXA7基因、HOXA9基因一样，都是KMT2A::AFF1融合蛋白的直接作用靶标，多项研究表明该融合蛋白的异常会导致MEIS1基因表达下降（46, 47）。我们在KMT2Ar型B-ALL样本中发现MEIS1基因位于A区域，而其他亚型的该基因则位于B区域（见图2F和G），这一结果与KMT2Ar型细胞更具干细胞特性、起源于CLP阶段或前B细胞阶段相符。在其他B-ALL亚型中，MEIS1基因失去了标记TAD结构的环结构，同时可及性降低[见图2F底部]，表达水平也有所下降（见图2H）。为验证与区域转换相对应的MEIS1基因的TAD结构及环结构，我们在SEM型KMT2Ar B-ALL细胞系、REH型ETV6::RUNX1 B-ALL细胞系以及4个患者样本（2个KMT2Ar型，2个ETV6::RUNX1型）中进行了荧光原位杂交分析，使用的探针针对MEIS1基因的启动子区域以及基因的3′端。在REH型ETV6::RUNX1 B-ALL细胞系中，我们并未在MEIS1基因启动子区域观察到CTCF峰值（见补充图S4A），并且发现REH细胞及ETV6::RUNX1型样本中探针间的距离明显大于SEM型KMT2Ar细胞系及患者样本中的距离（见补充图S4B和S4C）。我们的数据表明，在没有KMT2A::AFF1重排的情况下，随着细胞分化进程的推进，MEIS1基因会转移到B区域。鉴于我们对健康B细胞前体细胞的研究显示，与更成熟的B细胞相比，CLP阶段的PAX5基因所在区域的TAD活性较低（见图1G），因此我们又检测了ETV6::RUNX1型和KMT2Ar型B-ALL样本中的PAX5基因。我们在KMT2Ar型B-ALL样本中发现PAX5基因的启动子处于高度相互作用的TAD结构中（见补充图S4D）。有趣的是，ETV6::RUNX1型、KMT2Ar型B-ALL细胞以及前B细胞中的PAX5基因表达水平相当（见补充图S4E）。因此，尽管这些细胞中干细胞基因的表达水平与CLP阶段的细胞相似，但KMT2Ar型B-ALL细胞似乎已经向B细胞方向分化。相比之下，ETV6::RUNX1型B-ALL细胞则表现出类似前B细胞和B细胞的转录因子特征（见补充图S4F）。与MEIS1基因不同，MME（CD10）基因位于A区域，且在除KMT2Ar型B-ALL之外的所有B-ALL样本中均有表达，这一现象表明其他亚型，包括ETV6::RUNX1型，处于更晚的分化阶段（见补充图S4G–S4I）。这些研究结果表明，基因组结构的变化在调控那些已知可用于区分B-ALL亚型的基因表达方面起着重要作用。虽然某些结构变化可能与白血病分化停滞所处的发育阶段有关，但我们还发现了B-ALL与健康前体细胞相比所特有的区域状态。例如，所有B-ALL亚型中的EPHA7基因都位于A区域，而所有分析过的正常前体细胞中的该基因则位于B区域（见图2E、I和J）。这种编码受体激酶的基因在除KMT2Ar型之外的所有B-ALL样本中均有表达（见图2K）。我们在另一个独立的单细胞B-ALL测序研究组中进一步证实了EPHA7的异常表达，该研究组包含7组B-ALL三联样本（诊断期、缓解期和复发期的骨髓样本配对）以及4个健康骨髓样本（48）。我们发现，EPHA7在健康细胞和缓解期细胞中呈转录沉默状态，而在B-ALL样本中则表达升高（见补充图S5A）。在诊断期和复发期，Ephrin A型受体EFNA3和EFNA4的转录水平也高于健康细胞和缓解期细胞（见补充图S5B和S5C）。有趣的是，EPHA7基因表达水平较高的患者在所有样本中的无事件生存期和总生存期均显著更长。不过这一趋势可能主要由ETV6::RUNX1型亚型驱动，因为该亚型在我们的数据集中表达水平最高（见图2K），而且EPHA7表达较高的ETV6::RUNX1型患者其生存期也更长（见补充图S5D；参考文献49）。B-ALL中另一种特有的区域状态是DDK1基因，这是一种Wnt/B-catenin通路的负调控因子，在B-ALL样本中位于A区域，而在健康细胞中则位于B区域（见图2E）。所有分析过的B-ALL样本中均存在DDK1基因的高表达，且其高表达与更差的总生存期相关（见图2D；补充图S5E；参考文献49）。此外，DDK1还被认为与B细胞白血病的药物耐药性有关（50）。

KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型B-ALL中3D结构重排对下游效应分子的影响

基于KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型B-ALL亚型在区域分布和转录组特征上的差异（见图2B–E），我们试图通过将这些亚型的样本与最接近的已分化前体细胞进行比较，进一步明确这两种B-ALL亚型特有的3D染色体结构变化。比较依据是我们的数据以及其他类似研究结果（bioRxiv 2024.10.04.616668；参考文献51）。我们发现，大多数区域区间保持稳定，而在ETV6::RUNX1型亚型中，有1.5%的区间从A区域转变为B区域，3.3%的区间从B区域转变为A区域，相比而言，KMT2Ar型亚型中有2.3%的区间从A区域转变为B区域，1.8%的区间从B区域转变为A区域（见图3A；补充表S4和S5）。通过比较平均TAD活性的变化倍数，我们仅在KMT2Ar型亚型中发现了45个具有统计学显著性的TAD活性下降案例和157个上升案例[假发现率<0.1，|log2(FC)|≥0.32；见图3B；补充表S6]。类似地，在ETV6::RUNX1型亚型中，也有43个TAD活性显著下降案例和139个上升案例，相比其前B细胞阶段（见图3C；补充表S7）。其他亚型（HD型n=1，OTH型n=4，BCR::ABL1/-样型n=5，iAMP21型n=1）与对应的前体细胞（前B细胞n=3，预B细胞n=3）相比，其3D结构变化趋势也类似，大部分区域区间保持稳定，且白血病细胞中的TAD活性高于其健康对应细胞（见补充图S6A和S6B）。然而，由于这些亚型的样本数量有限，且各自的特征并不十分明显（HD型、BCR::ABL1/-样型、OTH型以及iAMP21型；见图2B–E），因此我们决定重点研究KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型亚型。图3. 查看大图 下载幻灯片 原位Hi-C分析可识别KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型B-ALL中亚型特异的3D染色质结构变化。A图为在40 kb区间尺度上，KMT2Ar型样本（n=5）与前B细胞样本（n=3）以及ETV6::RUNX1型样本（n=5）与预B细胞样本（n=3）之间的区域转换情况。A区域的定义为平均c评分大于0的区域，B区域则为平均c评分小于0的区域。只有当某个区间在第二个样本中的区域评分符号与参考样本（第一个样本）相比发生改变时，才被视为发生了区域转换，且两个区间评分的绝对差值需大于设定阈值（默认值为1.2）。B图和C图为火山图，展示了KMT2Ar型B-ALL样本（n=5）与前B细胞样本（n=3；共有1,850个TAD结构；B图）以及ETV6::RUNX1型B-ALL样本（n=5）与预B细胞样本（n=3；共有1,706个TAD结构；C图）之间TAD内部活性差异的情况。为识别两种细胞状态之间差异显著的TAD相互作用，我们以共有的TAD结构为基准，对每个共有TAD结构中的每一个单独相互作用对进行了配对双尾t检验。在B-ALL细胞中，与健康前体细胞相比，那些TAD结构的log2变化倍数≤?0.32且假发现率<0.1的，以红色标出；而那些TAD结构的log2变化倍数≥0.32且假发现率<0.1的，以蓝色标出。显著性判断采用双尾t检验方法。D图为在pro-B细胞样本（n=3）、预B细胞样本（n=3）、KMT2Ar型B-ALL样本（n=5）以及ETV6::RUNX1型B-ALL样本（n=5）中，MYO10基因位点（chr5:16300000-17500000）周围的Hi-C相互作用图。MYO10基因序列区域由黑色箭头标出。E图为通过RNA-seq检测的pro-B细胞样本（n=4）、预B细胞样本（n=4）、KMT2Ar型B-ALL样本（n=5）以及ETV6::RUNX1型B-ALL样本（n=7）中的MYO10基因表达水平。F值通过Kruskal–Wallis检验进行评估。图F展示了根据MYO10表达水平高于或低于中位数对ETV6::RUNX1型B-ALL患者（n=124）进行的无事件生存期和总生存期Kaplan–Meier曲线。P值是通过双侧时间分层Cochran–Mantel–Haenszel检验计算得出的。数据来源于圣裘德云可视化社区RNA-seq数据集（49）。图G则是对KMT2Ar型（n=5）和ETV6::RUNX1型（n=5）B-ALL中的A类（活跃）区室与相应的前B细胞（n=3）和早B细胞（n=3）祖细胞中的ATAC-seq峰值进行的Homer基序富集分析。其中，P值的log10值（通过二项式检验计算）显示了排名前10的显著结果。“n”表示所有图表中的生物学重复样本数。FPKM是指每百万转录本每千碱基对的片段数；TPM则是每百万转录本的数量。图3：查看大图/下载幻灯片。原位Hi-C分析揭示了KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型B-ALL中亚型特异的3D染色质结构变化。图A展示了在40 kb区间内KMT2Ar型（n=5）与前B细胞（n=3）以及ETV6::RUNX1型（n=5）与早B细胞（n=3）之间的区室转换情况。A类（活跃）区室被定义为平均c分数大于0，而B类（非活跃）区室则为平均c分数小于0。若某个区间在样本2中的区室评分符号与参考样本（样本1）相比发生了变化，且两者的区室评分绝对差值超过设定阈值（默认为1.2），则该区间被视为发生了转换。图B和图C为火山图，展示了KMT2Ar型B-ALL（n=5）与前B细胞（n=3；TAD数量为1,850；B组）以及ETV6::RUNX1型B-ALL（n=5）与早B细胞（n=3；TAD数量为1,706；C组）之间TAD内部活性的差异。为确定两种状态下TAD间的相互作用差异，我们选取了共同的TAD，并对每个共同TAD中的每一对相互作用区间进行了配对双侧t检验。与健康祖细胞相比，B-ALL中那些log2 FC≤?0.32且FDR<0.1的TAD数量有所增加（用红色标出），而那些log2 FC≥0.32且FDR<0.1的TAD数量则有所减少（用蓝色标出）。显著性是通过双侧t检验来确定的。图D展示了在pro-B细胞（n=3）、早B细胞（n=3）、KMT2Ar型B-ALL（n=5）和ETV6::RUNX1型B-ALL（n=5）中，围绕MYO10基因位点（chr5:16300000-17500000）的Hi-C相互作用图谱。MYO10基因本体由黑色箭头标记。图E通过RNA-seq技术测定了pro-B细胞（n=4）、早B细胞（n=4）、KMT2Ar型B-ALL（n=5）和ETV6::RUNX1型B-ALL（n=7）中的MYO10表达水平。显著性同样是通过Kruskal–Wallis检验来评估的。图F的内容与图F一致。FPKM和TPM的定义同前文。关闭模态窗口。

在KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型B-ALL中，处于不同活性TAD内的基因表现出一致的基因表达趋势（见补充图S6C）。例如，作为TP53信号通路组成部分的TP53INP1，在KMT2Ar型B-ALL中在结构和转录层面都受到了特异性抑制。与ETV6::RUNX1型B-ALL及其对应的健康细胞相比，TP53INP1基因位点的TAD活性下降，且与附近增强子之间的连接减弱，其表达水平也更低（见补充图S6D–S6F）。此外，通过对KMT2A::AFF1融合蛋白敲除组及对照组的B-ALL异种移植模型中公开可用的RNA-seq数据进行分析，我们发现当KMT2A::AFF1融合蛋白缺失时，TP53INP1的表达会恢复（见补充图S6G）。已有研究指出，TP53INP1表达下调会促进肿瘤细胞的迁移、增殖，并削弱其凋亡途径（52–56）。在ETV6::RUNX1型B-ALL中，肌球蛋白超家族中的非传统成员MYO10则表现出更高的区室和TAD活性以及表达水平（见图3D和E）。值得注意的是，ETV6::RUNX1型B-ALL中MYO10高表达的患者，其无事件生存期和总生存期明显更差（见图3F；参考文献49）。对与3D结构变化相关的差异表达基因进行的GO通路分析显示，KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型B-ALL分别存在若干亚型特异的通路，包括与运动/细胞迁移相关的通路以及与凋亡/细胞死亡相关的通路（见补充图S6H和S6I），这可能反映了KMT2Ar型B-ALL更具干细胞样特征。另外，细胞黏附是KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型B-ALL中最为显著的GO术语。在B细胞发育过程中，细胞黏附是一个关键过程——发育中的B细胞会通过趋化作用被引导至特定的骨髓位置，或者通过与骨髓基质分子的黏附来促进分化过程的进行（57–59）。有趣的是，在B细胞的分化和转化过程中，都观察到了与黏附相关的基因的3D结构变化；不过，其中包括MYO10在内的某些基因在转化后的B细胞中会出现异常激活现象（60, 61）。有趣的是，当在REH细胞中使用短发夹RNA降低MYO10的表达时，我们观察到这些细胞在接触骨髓基质细胞培养基后，其迁移能力下降（见补充图S6J和S6K）。为找出可能参与驱动上述B-ALL特异3D结构变化的转录因子，我们对KMT2Ar型和ETV6::RUNX1型B-ALL的活跃区室中与健康细胞相比所出现的可访问峰进行了基序分析。其中，一些富集度最高的转录因子在两种亚型中是共有的，但它们之间的排名差异或许能暗示出亚型特异的依赖关系。例如，ERG在ETV6::RUNX1型B-ALL中是富集度最高的转录因子（在目标序列中的占比为40.76%，而在背景序列中的占比为16.11%），但在KMT2Ar型样本中仅排在第六位（在目标序列中的占比为37.66%，而在背景序列中的占比为15.63%）。PU.1（SPI1）在KMT2Ar型B-ALL中是第二富集度最高的转录因子（在目标序列中的占比为19.94%，而在背景序列中的占比为4.28%），但在ETV6::RUNX1型B-ALL中仅排在第12位（在目标序列中的占比为17.12%，而在背景序列中的占比为4.50%；见图3G；补充表S8和S9）。目前尚未有证据表明KMT2A-AFF1会直接调控SPI1的表达；不过，KMT2Ar型白血病对PU.1的缺失十分敏感（62）。综合这些数据可以推测，KMT2A重排蛋白与ETV6::RUNX1可能会与其他转录因子如PU.1（SPI1）和ERG协同作用，共同形成一种有助于肿瘤发生的独特基因组结构。为探究3D结构重排对B-ALL生长的功能影响，我们基于一份精选的基因列表，分析了来自Dependency Map（DepMap，Chronos评分）的CRISPR依赖性数据。这份列表包含了在ETV6::RUNX1型B-ALL（与早B细胞相比）或KMT2Ar型B-ALL（与前B细胞相比）中发生3D结构和转录重排的基因，以及在各亚型活跃区室中富集度较高的转录因子。虽然我们发现了一些已知基因如MYC和RUNX1在两种亚型中都具有依赖性，但我们也发现了各自亚型中特有的基因，比如ETV6::RUNX1型B-ALL中的MDM2和KMT2Ar型B-ALL中的EZH2（见补充图S7A）。需要指出的是，鉴于TP53INP1和MYO10已知的生理功能，它们并非B-ALL生长所必需的基因，这一结果也在意料之中。与我们目前的观察结果一致，我们在ETV6::RUNX1型B-ALL中观察到ERG的依赖性更高。有趣的是，通过DepMap平台我们发现，与其它人类癌症相比，B-ALL细胞系对ERG的依赖性更强（见补充图S7B；参考文献63）。转录因子ERG能够维持ETV6::RUNX1型B-ALL的致癌状态。

为进一步验证转录因子ERG在人类B-ALL中的作用，我们选择了三种单导向RNA（sgRNA），并通过竞争性检测方法来评估它们对B-ALL细胞存活率的影响。在这三种sgRNA的作用下，SEM细胞和REH细胞在ERG缺失后其存活率均有所下降；不过，ETV6::RUNX1型REH细胞系的存活率下降幅度最大（见图4A–C）。当我们检测健康B细胞和B-ALL细胞中ERG的3D基因组结构时，发现ERG在早B细胞阶段就立刻失去了与其它基因的相互作用能力以及可访问性，同时在早B细胞和未成熟B细胞阶段其转录水平也会下降（见图4D–F）。有趣的是，与早B细胞和KMT2Ar型B-ALL细胞相比，ETV6::RUNX1型B-ALL细胞中ERG基因位点的相互作用能力仍然较高（见图4G），这一现象也与该基因位点的转录上调情况相吻合（见图4F）。我们在KMT2Ar型B-ALL细胞系、ETV6::RUNX1型B-ALL细胞系以及患者样本中通过FISH实验验证了ERG基因位点相互作用能力的增强。我们使用了针对ERG基因本体TAD边界的探针，发现ETV6::RUNX1型REH细胞中探针之间的相互作用频率高于KMT2Ar型SEM细胞中的频率（见图4H）。在患者样本中也观察到了类似的结果，尽管强度稍弱（见补充图S7C），这可能与KMT2Ar型样本中ERG的表达水平较低有关（见图4F）。图4：查看大图/下载幻灯片。ETV6::RUNX1型B-ALL中ERG活性及依赖性的增加。图A为来自对照组KO细胞（sgCTRL）和ERG KO细胞（sgERG）的SEM细胞及REH细胞的全细胞裂解液经ERG抗体免疫检测后的Western blot图像截图，肌动蛋白被用作加载控制蛋白。该实验重复了两次，结果相似。图B和图C展示了在诱导4天后，共表达绿色荧光蛋白（GFP）的ERG和对照组KO SEM细胞（B组）及REH细胞（C组）通过竞争性增殖检测法进行培养的情况。每隔4天测量一次GFP的百分比，并以第4天的数值作为标准化基准。阴性对照组、sgCTRL组以及三种针对ERG的独立sgRNA组的数据均以每隔4天的百分比形式呈现，其中生物重复样本数为相应数值。该实验重复了3次，技术重复样本数亦为3次，图中展示的是代表性的条形图，显示了平均值和标准差。图D展示了健康B细胞祖细胞（包括CLP细胞，n=2）、前B细胞（n=3）、早B细胞（n=3）和未成熟B细胞（n=3）中围绕ERG基因位点（顶部）的Hi-C相互作用图谱，以及将这些祖细胞与CLP细胞相比的log2（FC）值的热图（底部行）。ERG基因本体由黑色箭头标记。“n”表示生物学重复样本数。图E为针对每种相应细胞类型（未成熟B细胞除外，因为公共数据集中没有包含该类型的细胞）围绕ERG基因位点（chr21:39700000-40100,000）进行的伪批量scATAC-seq分析结果。红色框标出了ERG基因位点周围可访问性发生改变的区域。图F通过RNA-seq技术测定了CLP细胞、前B细胞和早B细胞中的ERG表达水平，各组的样本数分别为n=4、n=4、n=4、n=3、n=5和n=7，其中“n”表示生物学重复样本数。P值是通过单因素方差分析计算得出的。图G展示了前B细胞和早B细胞（两者样本数均为n=3；顶部）以及KMT2Ar型B-ALL细胞和ETV6::RUNX1型B-ALL细胞（两者样本数均为n=5；底部）中围绕ERG基因位点的Hi-C相互作用图谱，“n”表示生物学重复样本数。ERG基因本体仍由黑色箭头标记。前B细胞和早B细胞对应的顶部面板与图D中的图像相同，此处再次展示以便直接对比。图H通过DNA-FISH分析测定了SEM细胞和REH细胞系中ERG启动子与基因本体3′端之间的距离。探针距离分布之间的统计学差异是通过双样本单侧Kolmogorov–Smirnov检验来计算的。误差条表示标准差，中心数值表示中位数。REH细胞中的探针对数量为993对，SEM细胞中的探针对数量为2,001对（均为技术重复样本）。图中展示了ERG启动子及ERG-CEE探针的代表性图像。Chr表示染色体，mb表示兆碱基对，TPM表示每百万转录本的数量。图4：查看大图/下载幻灯片。ETV6::RUNX1型B-ALL中ERG活性及依赖性的增加。图A与图A内容一致。图B和图C仍为上述竞争性增殖检测实验的结果展示。D，健康B细胞前体细胞中，ERG基因位点周围存在Hi-C相互作用图谱（上方），这些细胞包括CLP（n=2）、pro-B（n=3）、pre-B（n=3）以及未成熟B细胞（n=3）；下方为这些前体细胞与CLP的log2(FC)值热图。ERG基因本体由黑色箭头标出，“n”表示生物学重复样本数。E，针对每种相应细胞类型（未成熟B细胞除外，因为公共数据集未包含该类型细胞），对ERG基因位点周围区域（chr21:39700000-40100,000）进行伪批量scATAC-seq分析。红色框标出了ERG基因位点周围可及性发生改变的区域。F，通过RNA-seq检测CLP、pro-B和pre-B细胞中的ERG表达情况，其中各组样本数分别为n=4，未成熟B细胞为n=3，KMT2Ar为n=5，ETV6::RUNX1为n=7，“n”同样表示生物学重复样本数。P值是通过单因素方差分析计算得出的。G，pro-B和pre-B细胞中ERG基因位点周围的Hi-C相互作用图谱（两者均为n=3，上方），以及KMT2Ar和ETV6::RUNX1 B-ALL细胞中的图谱（两者均为n=5，下方），“n”表示生物学重复样本数。ERG基因本体由黑色箭头标出。pro-B和pre-B细胞的顶部图像与D部分相同，此处再次展示以便直接对比。H，通过SEM和REH细胞系中的DNA-FISH分析，测量ERG启动子与基因本体3′端之间的距离。探针距离分布的统计差异是通过双样本单侧Kolmogorov–Smirnov检验计算得出的。误差条表示标准差，中间数值表示中位数。REH细胞系的探针对数为993；SEM细胞系的探针对数为2,001（技术重复样本）。图中展示了ERG启动子及ERG-CEE探针的代表性图像。Chr表示染色体，mb表示兆碱基对，TPM表示每百万转录本数。关闭模态框

为更深入了解ERG在B-ALL中所调控的转录程序，我们在用靶向ERG的sgRNAs或非靶向对照sgRNAs转导REH细胞4天后进行了RNA-seq分析（图5A）。在ERG缺失后，有346个基因的表达上调幅度超过0.5倍，另有289个基因的表达显著下调（图5A）。重要的是，我们发现B细胞分化过程中的关键基因在ERG缺失后会发生转录变化，包括B细胞关键调控因子SPIB、ID3、TUNAR、IKZF2和LYN的表达上调，而更具干细胞特性的基因如RUNX1、MECOM（EVI1）、IRX3和FLT3以及6号染色体上HLA基因簇中的许多基因则表达下调。我们还利用患者数据进一步验证了这些发现：在ETV6::RUNX1 B-ALL患者中，与健康的pre-B细胞和未成熟B细胞相比，SPIB和LYN的转录水平受到抑制，而这些健康细胞中ERG mRNA的表达水平较低（图4F）。相反，在B细胞分化过程中ERG缺失后，RUNX1和FLT3的表达水平下降，而在ETV6::RUNX1和KMT2Ar B-ALL细胞中，它们的表达水平却更高（补充图S7F和S7G）。图5. 查看大图 下载幻灯片 ERG通过影响转录程序和3D染色质环化结构来维持ETV6::RUNX1 B-ALL的白血病状态。A，控制组KO细胞（sgCTRL；n=2）与ERG KO细胞（sgERG；n=3，生物学重复样本）中差异表达基因的热图，筛选标准为|log2 FC| ≥0.5且P值≤0.005。B，ERG结合的启动子区域（P值≤0.05，通过ERG ChIP-seq确定）与差异表达基因的叠加图，差异表达基因通过RNA-seq检测，比较对象为sgCTRL和sgERG REH细胞。C，条形图显示sgCTRL和sgERG REH细胞中常见的或细胞系特异的H3K27ac HiChIP环化结构的总数。环化结构识别的分辨率為10 kb，q值≤0.01，最小距离为10 kb，最大距离为10 Mb。D，散点图显示常见环化结构以及sgCTRL特有和sgERG特有环化结构的接触次数（其中一个轴上的值为0）。在sgERG细胞中，接触次数增加的环化结构表明其相互作用更强，而在sgCTRL细胞中，接触次数减少的环化结构则表明其相互作用更强。E和F，sgCTRL和sgERG REH细胞中RUNX1基因（E）和FLT3基因（F）的H3K27ac HiChIP、ERG和H3K27ac ChIP-seq以及RNA-seq分析结果，以相对于输入数据的富集倍数形式呈现。DEG表示差异表达基因。图5. 查看大图 下载幻灯片 ERG通过影响转录程序和3D染色质环化结构来维持ETV6::RUNX1 B-ALL的白血病状态。A，控制组KO细胞（sgCTRL；n=2）与ERG KO细胞（sgERG；n=3，生物学重复样本）中差异表达基因的热图，筛选标准为|log2 FC| ≥0.5且P值≤0.005。B，ERG结合的启动子区域（P值≤0.05，通过ERG ChIP-seq确定）与差异表达基因的叠加图，差异表达基因通过RNA-seq检测，比较对象为sgCTRL和sgERG REH细胞。C，条形图显示sgCTRL和sgERG REH细胞中常见的或细胞系特异的H3K27ac HiChIP环化结构的总数。环化结构识别的分辨率為10 kb，q值≤0.01，最小距离为10 kb，最大距离为10 Mb。D，散点图显示常见环化结构以及sgCTRL特有和sgERG特有环化结构的接触次数（其中一个轴上的值为0）。在sgERG细胞中，接触次数增加的环化结构表明其相互作用更强，而在sgCTRL细胞中，接触次数减少的环化结构则表明其相互作用更强。E和F，sgCTRL和sgERG REH细胞中RUNX1基因（E）和FLT3基因（F）的H3K27ac HiChIP、ERG和H3K27ac ChIP-seq以及RNA-seq分析结果，以相对于输入数据的富集倍数形式呈现。DEG表示差异表达基因。关闭模态框

为阐明ERG对ETV6::RUNX1 B-ALL细胞转录重编程的调控机制，我们在REH细胞中进行了ERG染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析，同时还在ERG基因敲除细胞和对照REH细胞中进行了H3K27ac ChIP-seq和HiChIP分析。在ERG基因敲除后出现表达异常的635个基因中，有462个（73%）在其转录起始位点直接与ERG结合（图5B），这表明ERG在它们的转录调控中起着直接作用。通过对那些在转录起始位点直接与ERG结合的差异表达基因进行基因富集分析，我们发现细胞死亡和免疫相关通路是富集程度最高的通路之一（补充图S8A），这一结果与我们之前对ETV6::RUNX1白血病与正常前体细胞在3D结构方面的分析结果一致（补充图S6I）。我们还通过Annexin V染色实验功能性地验证了这些发现：在用sgRNA使ERG沉默后，REH细胞中的细胞凋亡率上升（补充图S8B）。HiChIP数据分析结果显示，共有42,794个环化结构至少有一个通过ChIP-seq检测到H3K27ac富集的锚点，而在ERG基因敲除后，其中44%（18,865个）的环化结构消失了（或者仅存在于对照组中）（图5C）。此外，即使在常见的环化结构中，与对照组相比，ERG基因敲除细胞中的大多数环化结构的接触频率也有所下降（图5D）。值得注意的是，尽管这些强度减弱的环化结构中有62.4%至少与一个ERG结合位点存在重叠，但有54%的稳定环化结构也存在重叠（补充图S8C），这说明虽然ERG对于维持白血病状态下所需的3D染色质结构至关重要，但其他转录因子和表观遗传调控因子也参与其中。为证明ERG对那些对细胞分化至关重要的基因具有直接调控作用，我们重点研究了RUNX1和FLT3基因，这两个基因在ERG基因敲除细胞中均出现表达下调（图5A）。研究发现ERG与RUNX1基因的启动子和基因本体上的多个位点结合，而在ERG基因敲除后，RUNX1基因位点的染色质环化结构明显减少（图5E）。类似地，ERG也存在于FLT3基因的转录起始位点和基因本体上。ERG沉默导致FLT3基因位点内的DNA相互作用减少，这一现象可通过H3K27ac Hi-ChIP检测到，尤其是在FLT3基因转录起始位点上游的远端区域（图5F）。许多基因也呈现出类似的ERG DNA结合丧失、3D染色质环化结构减少以及mRNA表达下降的趋势。最初，我们重点研究了HLA II类基因座，发现从ERG结合的HLA-DRA启动子区域到HLA-DRB基因簇上游区域的环化结构减少，同时ERG也可能结合在HLA-DOB和HLA-DPA1基因附近的增强子区域（补充图S8D）。此外，基于我们之前发现的ETV6::RUNX1样本中高水平的TAD活性和表达以及其与患者生存率的关联（图3D–F），我们还研究了MYO10基因座。在ERG基因缺失后，MYO10基因的表达也出现下降（图5A）。MYO10基因座中，从ERG结合位点开始到基因本体以及上游区域的环化结构都出现了减少（补充图S8E）。总体而言，我们的研究结果表明，ERG在B-ALL中，尤其是ETV6::RUNX1亚型中，对染色质结构组织和基因表达起着重要且直接的作用。讨论

在本研究中，我们发现了与人类B细胞分化相关的3D基因组结构变化，以及特定于B-ALL亚型的结构重塑现象，这类重塑会影响染色质区室和TADs的结构。我们观察到有一部分基因位点发生了对细胞分化至关重要的结构重塑，其中包括造血干细胞基因以及B细胞发育过程中必需的基因。我们的数据表明，基因组结构的重塑是人类B细胞发育过程中一个持续且渐进的过程，这一结论与之前在初级小鼠骨髓B细胞中的研究结果一致（11, 15, 22, 64）。要确定B细胞白血病的确切起源阶段（即细胞起源类型）仍然是一个挑战，尤其是因为用于识别健康前体细胞的表面标志物可能会异常表达。我们的研究表明，ETV6::RUNX1和KMT2Ar B-ALL患者在与它们潜在分化阶段相关的基因中存在亚型特异性的3D基因组结构变化。例如MME（CD10）基因座，在KMT2Ar B-ALL样本中，该基因座处于非活跃状态（属于B区室），且转录沉默，这一特征与该亚型起源于细胞分化的早期阶段相符。在胎儿淋巴细胞发育过程中，O’Byrne及其同事（65, 66）以及其他研究者已经证实存在CD10?的pre–pro-B细胞群体，而这种细胞在成年骨髓中并不存在。这些胎儿期前体细胞的转录程序与CD10? CD19+KMT2Ar B-ALL细胞的转录程序非常相似（66）。尽管MME基因的表达受到抑制，但KMT2Ar B-ALL细胞仍属于B细胞定向分化的细胞类型，这一事实可从决定B细胞特性的关键转录因子PAX5的活性中得到体现。KMT2Ar B-ALL细胞还像CLP和pro-B细胞一样，将MEIS1基因座保持在活跃状态，而ETV6::RUNX1和BCR::ABL1 B-ALL细胞则将该基因座置于非活跃状态，类似于pre-B细胞和未成熟B细胞的情况。MEIS1基因对KMT2Ar白血病的发展至关重要（67）。与MEIS1类似，ERG在pro-B细胞阶段之后也会在结构和转录层面被关闭。尽管大多数其他具有干细胞特性的基因表达都出现下调，但更为成熟的ETV6::RUNX1 B-ALL细胞在ERG基因位点仍保持较高的相互作用频率和基因表达水平。我们的研究结果与Iacobucci及其同事的研究结果一致，他们也通过单细胞RNA-seq技术将B-ALL细胞在正常B细胞发育过程中的位置进行了定位（8）。KMT2Ar型白血病细胞往往与早期的淋巴系前体细胞聚集在一起，但融合基因的不同可能会影响具有特定发育阶段的细胞数量。KMT2A::AFF1型白血病细胞中早期淋巴系样细胞的占比较高，而KMT2A::MLLT3和KMT2A::MLLT10型白血病细胞则更多表现为pre-B细胞样的特征。相比之下，ETV6::RUNX1 B-ALL细胞则与后期pro-B淋巴系前体细胞更为相似。我们的研究结果表明，ETV6::RUNX1 ALL的起源更接近pre-B淋巴系前体细胞。此外，我们的研究还发现了独特的结构变化，这些变化既有亚型特异性，也有大多数白血病共有的特征，它们能够驱动一些此前未被认为在细胞转化过程中起作用的基因的表达。其中一个例子就是MYO10，这是一种非典型的肌球蛋白，已知它会在丝状伪足的末端积累，从而在癌细胞迁移和转移过程中发挥作用（60）。已有研究表明，MYO10可作为多种实体瘤肿瘤侵袭性和预后的生物标志物，这些实体瘤包括结直肠癌（68）、乳腺癌（69）、宫颈癌（70）和鳞状细胞肺癌（71），以及儿童肿瘤神经母细胞瘤（72）。高水平的MYO10与细胞增殖加剧、基因组不稳定以及炎症反应有关（73）。此外，MYO10水平的升高还会提高细胞对紫杉醇等微管毒素的抵抗能力（74）。据我们所知，此前尚未有研究报道MYO10在白血病发生中的作用，而我们的研究则表明，MYO10在B-ALL细胞的趋化过程中也发挥着作用。这里所报告的ETV6::RUNX1 B-ALL细胞中MYO10水平升高的预后意义表明，它可能在细胞转化过程以及对治疗的反应中发挥重要作用。同样，我们还发现B-ALL细胞中ephrin受体A7（EphA7）及其配体EphA3和EphA4的表达水平也有所上升。EphA7可在多种肿瘤中影响细胞的增殖、迁移和凋亡过程。有趣的是，它在乳腺癌、胶质母细胞瘤、肝母细胞瘤、胰腺癌和骨肉瘤中具有致癌作用，但在前列腺癌、结直肠癌和黑色素瘤中则起到肿瘤抑制作用（75）。不过，在T-ALL（76）和滤泡性淋巴瘤（77）中它似乎是肿瘤抑制因子。尽管在白血病中对于EPHA7的研究较少，但KMT2A::AFF1和KMT2A::MLLT3融合蛋白已被证明能够与它的启动子结合，促使其过度表达，并增加ERK的磷酸化水平（78）。我们的数据表明，无论B-ALL的亚型如何，EPHA7的表达都可能在其中起关键作用。最后，我们发现转录因子ERG在B-ALL中具有多重功能。虽然已知ERG通过与重要的B细胞调控因子EBF1和PAX5相互作用，对正常B细胞的发育至关重要，但有证据表明ERG在B-ALL中的转录重编程会对不同亚型产生特定影响（79, 80）。我们发现，与正常的预B细胞相比，ETV6::RUNX1激活的染色质区域中ERG基序更为丰富，这表明ERG有助于维持该亚型的致癌性3D基因组结构。这一发现与Barnett及其同事的研究结果一致（81），他们发现包括ERG在内的能与GGAA重复序列结合的因子在ETV6::RUNX1激活的区域中更为集中。此外，Kodgule及其同事（79）发现，在缺乏ETV6的B-ALL细胞中，ERG会直接与GGAA微卫星增强子结合，且对于激活已知的ETV6::RUNX1特征基因至关重要，这表明ERG在该亚型的B-ALL中具有表观遗传调控功能。有趣的是，在我们的模型中，由于ERG的缺失，一些原本被ETV6抑制的基因出现了异常表达，这说明存在复杂的调控网络。很可能ERG能促进B-ALL细胞的存活，使这些白血病细胞抵抗凋亡，同时还能控制分化相关的调控因子。在本研究中，我们发现ERG通过抑制SPIB等基因来维持B-ALL中的分化障碍，而SPIB此前已被证实是B-ALL中的肿瘤抑制因子（82, 83）。此外，ERG还维持了RUNX1和FLT3的表达，这两个基因在急性白血病中也有重要作用。这些发现支持了早期将ERG活性与B-ALL联系起来的研究。最近还有研究指出，ERG也会在EVI驱动的AML中促进分化障碍的发生（84）。另外，ERG存在于21号染色体上的唐氏综合征关键区域。遗传学研究显示，唐氏综合征患儿患ALL的风险较高，这部分可能是因为ERG的过度表达（85）。相反，通过基因缺失或表达显性负性异构体来降低ERG表达，可改善IKZF1突变和DUX4重排型B-ALL的预后（86–88）。正如在前列腺癌中所提出的那样，针对ERG可能是治疗B-ALL的一种方法（89, 90）。我们对正常和恶性人类B细胞前体细胞中的3D染色质结构、可及性以及基因表达进行了综合分析，揭示了正常B细胞分化的3D基因组结构及其相关转录程序的演变，以及这种3D核结构在白血病发生过程中的独特作用。转录后的DNA随后使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix混合液进行扩增（KAPA，KR0370）。经过大小筛选和TapeStation处理后，这些文库在NYU基因组技术中心通过Illumina NovaSeq 6000平台以150bp的配对端读长进行测序，每份样本的测序量约为2000万对读长，RRID编号为SCR_016387。ATAC-seq数据则使用Seq-N-Slide流程进行处理（RRID：SCR_021752）。配对端读长通过Bowtie2（v2.3.4.1）与人类参考基因组hg19进行比对。那些映射质量低于30以及重复的读长会被剔除。初步处理完成后，使用MACS2（v2.1.1；RRID：SCR_013291）算法识别出峰值。为了便于查看单个样本的情况，还使用deepTools（v3.1.0；RRID：SCR_016366）生成了BigWig轨道图。通过ChIPseeker工具对最接近的基因进行标注（RRID：SCR_021322）。TF基序富集分析则是借助HOMER基序分析软件完成的（RRID：SCR_010881）。

scATAC-seq可视化

为研究B细胞发育过程中的染色质可及性，我们使用了来自人类骨髓单核细胞的公开scATAC-seq数据（39）。我们采用了原始研究中的细胞类型标注，并使用Signac R软件包对数据进行可视化处理（RRID：SCR_021158；参考文献92）。

ChIP-seq文库制备与分析

在对照组或ERG靶向引导序列转导4天后，REH细胞（200k）在2%甲醛中发生交联处理。提取细胞核后，使用Diagenode Bioruptor设备进行超声处理，参数为30秒工作、30秒休息，共20分钟。之后，用20微升的Protein G Dynabeads（Life Technologies，10004D）在4摄氏度下旋转1小时，以清除DNA片段。然后将上清液转移到新的DNA LoBind管中，加入5微克的抗H3K27ac抗体（Abcam，编号ab4729，RRID：AB_2118291），样品在4摄氏度下过夜培养。次日，再加入20微升的Protein G Dynabeads，继续在4摄氏度下旋转2小时。珠子捕获DNA后，依次用低盐、高盐以及LiCl洗涤缓冲液清洗。随后对样品进行洗脱处理，再经过蛋白酶K处理。清理完成后，使用Takara Bio的ThruPLEX DNA-seq试剂盒制备文库（R400674）。经过大小筛选和TapeStation处理后，这些文库同样在NYU基因组技术中心通过Illumina NovaSeq 6000平台以100bp的配对端读长进行测序，每份样本的测序量约为2000万对读长，RRID编号为SCR_016387。读长通过Seq-N-Slide流程与hg19基因组进行比对（RRID：SCR_021752）。初步处理完成后，再次使用峰值识别算法找出峰值，进而通过DESeq2软件进行差异峰值分析。

HiChIP-seq文库制备与分析

HiChIP文库是根据制造商的方案稍作修改后，使用Arima-HiC+试剂盒（A410232）、Swift Biosciences的Accel-NGS 2S Plus DNA文库试剂盒（编号21024）以及Accel-NGS 2S Plus DNA索引试剂盒（编号26148）制备的。经过原位邻近连接处理后，样品在Covaris LE220-plus聚焦超声波仪上进行处理，参数为4摄氏度、300瓦特、15%的工作强度，每次脉冲200次，总共处理300秒。之后，用Protein G珠子将样品预清除1小时，随后在4摄氏度下与5微克的H3K27AC抗体共同孵育过夜。免疫沉淀完成后，使用KAPA文库扩增试剂盒（编号KK2620）对文库进行扩增和定量。最终的文库在NYU基因组技术中心通过Illumina NovaSeq 6000平台进行测序，RRID编号为SCR_016387。HiChIP读长通过Burrows-Wheeler Aligner工具与GRCh37/hg19人类参考基因组进行比对（RRID：SCR_010910）。用于后续分析的读长是通过Hi-C-bench平台上的GenomicTools tools-hic过滤命令筛选出的合格染色体内读长对（sgERG的重复样本数为2个，sgCNTRL的重复样本数为1个）。Hi-C-bench平台以40 kb的分辨率分别为每条染色体生成交互矩阵。为考虑较远基因座读长数量的差异，还对每个染色体矩阵进行了距离标准化处理。在Hi-C-bench平台上，通过“loops”和“loops-diff”步骤进行环结构分析。那些有效的相互作用对则通过Fit-Hi-C工具进行识别，识别参数为：分辨率10 kb，q值≤0.01，最小距离10 kb，最大距离10 Mb。那些没有H3K27ac峰值与环结构锚点重叠的环会被剔除。为避免因sgCNTRL和sgERG之间的峰值数量差异而产生的偏差，我们没有使用各自的ChIP-seq信号，而是整合了sgCNTRL和sgERG的峰值，得到一个共识信号，共计68,279个峰值。这些环被分为sgCNTRL特异性、sgERG特异性或是共同的环。对于共同的环，还根据log2 FC阈值是否大于1，进一步分为增加型、减少型或稳定型。如果某个环仅在样本“x”中被认定为有显著意义，而在样本“y”中则没有，且满足q值截止标准“qcut1”（默认值为0.01），同时在该环在更宽松的“qcut2”截止标准下（默认值为0.1）在样本“y”中也不具备显著意义，那么这个环就被视为样本特异性环。设置这样的标准是为了避免在两个样本中的显著性差异比较接近时仍将其判定为样本特异性环；而有些环在其中一个样本中的显著性低于截止值，属于显著，而在另一个样本中的显著性略高于截止值，不属于显著，这类环则被归为共同环。所谓减少型环，指的是在sgERG中数量有所减少的环，其原因可能是它们原本是sgCNTRL特异性环，在sgERG中消失了，或者原本是共同环，但在sgERG中数量减少了。

3D DNA FISH

探针针对的是在MEIS1和ERG基因位点上具有明显差异性Hi-C相互作用的TAD边界。与非编码链互补的探针序列是从paintSHOP.io获取的，之后通过添加常见的5′和3′引物序列对其进行了修改（93）。这些探针组被整合为单链DNA池，由Integrated DNA Technologies提供，随后进行扩增处理（oPools Oligo Pools），并按照现有流程直接进行标记，具体步骤如下：首先对单链DNA模板进行有限循环PCR扩增，然后纯化PCR产物（QIAGEN，编号28104）；接着通过体外转录方式对产物进行扩增（New England Biolabs，编号E2040S），再纯化体外转录产物（Macherey-Nagel，编号740948.50）；随后使用带有预标记引物（Alexa-555或Cy5）的逆转录反应直接对产物进行5′端标记（Thermo Fisher Scientific，编号18090010）；接着纯化ssDNA-RNA杂交产物（Zymo Research，编号R1054）；再用RNase A（Thermo Fisher Scientific，编号EN0531）和RNase H（New England Biolabs，编号M0297S）消化残留的RNA；最后再次纯化已标记的ssDNA探针（Zymo Research，编号R1054）。这些探针组的浓度是用NanoDrop仪器（Thermo Fisher Scientific，ND-ONE-W）检测的，之后分装并储存在避光条件下、温度为-20摄氏度的管子里，等待使用（94, 95）。DNA FISH探针组的hg19坐标如下：MEIS1上游区域位于chr2染色体上，坐标范围为66651183–66661438；MEIS1下游区域位于同一染色体上，坐标范围为66797528–66807727；ERG上游区域位于chr21染色体上，坐标范围为39744698–39754927；ERG下游区域位于同一染色体上，坐标范围为39872649–39882905。探针组PCR引物序列为：正向引物为5′ CGTGGTCGCGTCTCA 3′，反向引物为5′ TAATACGACTCACTATAGGG 3′。直接标记的逆转录引物为：（Cy5）– TAATACGACTCACTATAG。

样本的制备以及寡核苷酸DNA FISH操作与其他实验类似（96–98）。首先将融合在一起的细胞沉降到涂有0.01%聚L-赖氨酸的载玻片上，每张载玻片上放置两个细胞点。在4%多聚甲醛中固定细胞10分钟后，用PBS冲洗载玻片两次，然后在0.5% Triton X-100/PBS溶液中进行渗透处理，渗透比例为体积比。冲洗过后，将载玻片在20%甘油/PBS溶液中浸泡20分钟，之后在-20摄氏度的50%甘油/PBS溶液中保存1到2天。随后将载玻片重新置于20%甘油/PBS溶液中使其恢复到室温，再用PBS冲洗，接着在0.1 N盐酸中浸泡5分钟，再次用2×盐水-柠檬酸钠缓冲液冲洗3次，每次1分钟。最后将载玻片置于预杂交溶液中平衡30分钟，该预杂交溶液的成分包括50%甲酰胺、10%右旋糖酐硫酸盐、pH值为6.0的9毫米摩尔/升柠檬酸盐缓冲液、0.1%吐温-20、1×Denhardt溶液、0.4毫克/毫升的BSA以及用超纯水稀释5倍的5×SSC溶液（Thermo Fisher Scientific，编号10977015，所有组分均为最终浓度）。将每种探针组各4皮摩尔混合到20微升的杂交缓冲液中，该缓冲液的成分也与上述预杂交溶液相同。每种探针杂交混合物先在70摄氏度下预变性5分钟，之后放在冰上冷却直至使用。每个细胞点会被加入约10微升的探针杂交混合物，随后用22×22毫米的盖玻片和橡胶粘合剂将载玻片密封，再将载玻片放入部分浸没在水浴中的铝块上，在86摄氏度下变性3分钟。之后将载玻片转移到37摄氏度的恒温培养箱中过夜进行杂交。第二天，用镊子小心地移除橡胶粘合剂，然后将载玻片放入装有2×SSC溶液的Coplin罐中，在37摄氏度下放置。接着将载玻片在探针洗涤液中分别浸泡2次，每次30分钟，该洗涤液的成分与预杂交缓冲液相同。之后再用5×SSC溶液在室温下洗涤2次，每次5分钟。最后用Hoechst染液（Thermo Fisher Scientific，编号H1399）在室温下对细胞核进行染色5分钟，随后再用PBS冲洗。之后将载玻片封存在ProLong Gold封片剂中（Thermo Fisher Scientific P36930），使用24×50毫米、1.5H精度的盖玻片（Thorlabs，编号CG15CH）进行封存，过夜固化后密封，最后进行成像。每种实验条件下都会设置两个重复样本。成像是在一台定制的、由MicroManager控制的荧光显微镜上自动完成的，该显微镜配备了数值孔径为1.35的100倍硅胶浸没式物镜（Nikon；参考文献99, 100）。每个样本会拍摄25到36组图像堆栈，图像的体素大小为109 × 109 × 250纳米。MEIS1和ERG之间的相互作用是通过三种不同波长的激发激光来成像的，分别是405纳米、561纳米和637纳米。图像分析是借助一套自定义的流程来完成的，该流程包括在Fiji软件中进行伪平场校正和对比度调整（RRID：SCR_002285），在CellProfiler图像分析软件中生成细胞核掩模（RRID：SCR_007358），使用AIRLOCALIZE工具实现亚像素精度的3D定位，利用预置在用于封片嘅盖玻片上的多色荧光TetraSpeck 0.1微米微球（Thermo Fisher Scientific T7279）对通道依赖性的像差和位移进行校正，最后使用自定义的MATLAB脚本（RRID：SCR_001622，即AIRLOCALIZE工具；参考文献101–103）进行相互最近的邻域分析。上述提到的通道依赖性像差和位移是通过一个自定义的3D注册模型来校正的，具体做法是：首先为每张载玻片采集TetraSpeck微球的5×5网格扫描数据，然后分析这些数据，以此建立通道之间3D偏移量与像素位置之间的关系。在进行实际距离分析之前，会对从相应载玻片上获取的DNA FISH斑点定位数据应用这些校正值。那些在某个通道中拥有少于2个或超过4个FISH斑点的细胞会被排除在分析之外。接着，通过威尔科克森秩和检验这种非配对数据的方法，来判断一个细胞系中的FISH斑点与另一个细胞系中的FISH斑点之间的中位数实际距离是否存在显著差异。其中，H0假设为两种细胞系中目标区域之间的中位数实际距离是相同的；HA假设为两种细胞系中目标区域之间的中位数实际距离存在差异。

西方印迹法

首先使用BCA试剂测定裂解液中的蛋白质浓度，然后取10微克蛋白质样本来加载到4%到12%的Bis-Tris蛋白凝胶上（Bio-Rad，编号4561096）。蛋白质从凝胶上转移下来后，聚偏二氟乙烯膜会用不同的抗体进行探测，这些抗体包括抗ERG的兔多克隆抗体，浓度为1:1,000，编号为BMI-1（Abcam，编号ab133264，RRID：AB_11156852）；抗MYO10的兔多克隆抗体，浓度也为1:1,000，来自Thermo Fisher Scientific，编号为PA5-55019，RRID：AB_2644356；还有抗肌动蛋白的小鼠单克隆抗体，浓度为1:10,000，来自Abcam，编号为ab6276，RRID：AB_2223210。

细胞凋亡分析

细胞凋亡分析是使用APC Annexin V试剂（BD Biosciences，编号561012，RRID：AB_2034024）进行的，操作过程遵循制造商提供的说明，同时还会用DAPI抗体（RRID：AB_2869624）对细胞进行染色，以便检测细胞内的DNA含量。染色完成后，通过流式细胞术以及FlowJo软件对细胞进行分析（RRID：SCR_008520）。所有样本都会根据前向散射光和侧向散射光信号进行分组，之后会排除出现双峰信号的细胞（见补充图S1B）。随后，通过基于Annexin V_APC和DAPI信号的象限分组方法，来确定细胞凋亡的百分比。

化学趋化性细胞迁移实验

REH细胞被设计为表达一种非靶向shRNA，或者表达三种不同的MYO10靶向shRNA中的某一种。这些用于shRNA表达的质粒是从MilliporeSigma公司购买的，对应的编号分别为TRCN0000123087 shRNA1、TRCN0000123088 shRNA2以及TRCN0000298630 shRNA3。首先将REH细胞系在无血清条件下培养3小时，之后将250,000个细胞放入24孔板中的迁移插件内。在插件外部的孔中则注入含有25% HS-5间质细胞条件培养基的培养液。经过24小时的迁移后，插入物外的细胞与裂解缓冲液/染料溶液混合，然后按照制造商的说明在480/520纳米波长处检测荧光（QCM Chemotaxis Cell Migration Assay，24孔版，3微米，MilliporeSigma，产品编号ECM505）。该实验每项重复3次，每次设置两个样本组。主要联系人

如需更多信息或申请相关试剂，可联系主要联系人Iannis Aifantis（[e-mail]）进行处理。数据可用性

本研究通过高通量测序生成的所有原始数据及处理后的数据文件（包括Hi-C、ATAC-seq、RNA-seq和H3K27ac数据）均已存入美国国家生物技术信息中心的基因表达组学数据库（GEO；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），可通过GEO系列编号GSE243299获取这些数据。Kaplan–Meier生存曲线是使用St. Jude Cloud Visualization Community软件生成的，所用数据来自1,988份被诊断为B-ALL的原发性患者样本的批量RNA-seq分析结果。作者利益披露

R.S. Cathelin在本次研究之外获得了Myeloma Solutions Fund的资助；N. Saiz在研究期间获得了美国国家癌症研究所（NCI）和国家人类基因组研究所的资助；M.T. Witkowski在本次研究之外获得了Walter and Eliza Hall Institute的其他支持；E. Raetz在本次研究之外获得了Bristol Myers Squib的其他支持；D.T. Teachey在研究期间获得了美国国立卫生研究院（NIH）的资助，同时还获得了Amgen、Jazz Pharmaceuticals、Merck、Johnson & Johnson Innovation、AstraZeneca、Autolus、Servier、Pfizer、Sobi、Novartis和AbbVie等公司的非资金支持，此外还获得了Beam Therapeutics的资助和非资金支持；T. Lionnet在研究期间获得了NIH/NCI、NIH/NIA以及NIH/国家普通医学科学研究所的资助，同时还获得了Promega和Tocris Bioscience的其他支持。其他作者均未报告任何利益冲突。作者贡献

Y.E. Ghebrechristos：概念设计、资源协调、定量分析、实验监督、资金筹集、结果验证、研究实施、数据可视化、方法设计、初稿撰写、论文审阅与修改。N.A. Evensen：概念设计、资源协调、定量分析、实验监督、资金筹集、研究实施、方法设计、初稿撰写、论文审阅与修改。R.S. Cathelin：概念设计、资源协调、定量分析、实验监督、资金筹集、论文审阅与修改。S. Lee：概念设计、定量分析、实验监督、研究实施、方法设计、初稿撰写、论文审阅与修改。F. Clark：概念设计、定量分析、结果验证、研究实施、数据可视化、方法设计、初稿撰写。N. Saiz：概念设计、资源协调、实验监督、资金筹集、研究实施。S. Clarke：定量分析。M.T. Witkowski：实验监督、研究实施、论文审阅与修改。Z. Lin：定量分析。S. Narang：定量分析。H. Zhou：定量分析、实验监督、研究实施、论文审阅与修改。E. Raetz：定量分析。D.T. Teachey：定量分析。T. Lionnet：概念设计、资源协调、实验监督、资金筹集、研究实施。A. Tsirigos：概念设计、资源协调、实验监督、资金筹集、研究实施、论文审阅与修改。W.L. Carroll：概念设计、资源协调、定量分析、实验监督、资金筹集、论文审阅与修改。I. Aifantis：概念设计、资源协调、定量分析、实验监督、资金筹集、论文审阅与修改。致谢

I. Aifantis得到了Vogelstein家族基金会、St. Baldrick’s基金会、Andrew McDonough B+基金会以及NIH/NCI（1RO1CA228135、1PO1CA229086、1RO1HL159175和R01CA266212）的资助。W.L. Carroll获得了NIH/NCI（R01CA140729和R01CA260028）、白血病与淋巴瘤协会专门研究中心（7010-14）、Perlmutter癌症中心Arline和Norman M. Feinberg淋巴系统恶性肿瘤研究启动基金、Hyundai Hope on Wheels学者希望基金以及Perlmutter癌症中心（P30 CA016087）的资助。TL获得了NIH（R01CA260028、R01AG075272）的资助。AT获得了NIH（1RO1CA252239、5P30CA0160087和1PO1CA229086）的资助。我们要感谢基因组技术中心（GTC，尤其是Paul Zappile和Gael Westby）在文库制备和测序方面提供的专业支持。该GTC是由Laura和Isaac Perlmutter癌症中心的癌症中心支持基金P30CA016087部分资助的共享资源。本研究还使用了纽约大学医学院的高性能计算设施中的计算资源。同时，我们也要感谢国家临床试验网络（NCTN）运营中心提供的U10CA180886号资助，这些资助用于获取生物样本。注意：本文的补充数据可在《血液癌症发现》在线版上查看（https://bloodcancerdiscov.aacrjournals.org/）。