综述：壳聚糖纳米颗粒的生产与性能研究评述：通过三聚磷酸钠离子凝胶化制备在农业生物技术中具有应用前景的纳米颗粒

《Polymers》：A Critical Review of Research on the Production and Properties of Chitosan Nanoparticles, Promising for Agrobiotechnology, Obtained Through Ionic Gelation with Sodium Tripolyphosphate

　　

氨基多糖壳聚糖(Chitosan, Ch)纳米颗粒(ChNPs)是用于农业生物技术应用中生物活性物质的有效递送平台，在解决可持续和高效农业的精准问题方面具有巨大前景。本综述分析了过去20年的研究出版物，这些出版物研究了通过离子凝胶化(Ionotropic Gelation)方法使用三聚磷酸钠(Sodium Tripolyphosphate, TPP)交联大分子链来生产ChNPs的方法，这些方法对农业具有实际意义。研究人员分析了纳米结构形成过程的关键方面，包括氨基多糖(Aminopolysaccharide)的物理化学特性、试剂浓度和比例以及离子交联条件对纳米颗粒平均粒径、粒径分布(多分散性, Polydispersity)和zeta电位(Zeta Potential)的影响。特别注意了文献中提出的几种确定最佳凝胶化条件以获得具有预定粒径特性的ChNPs的方法。研究人员考虑了基于这些纳米颗粒的纳米结构制剂在农业生物化学目的潜在应用，包括封装抗真菌、抗病毒和抗菌剂、农药、氮磷钾(NPK)肥料、金属离子、植物提取物、精油等，以开发用于种子萌发和植物生长的可生物降解刺激剂，提高作物产量和改善农产品质量。研究人员得出结论，阻止壳聚糖的质子化氨基与三聚磷酸根阴离子的交联是不可取的，因为这会导致大分子和由此制得的纳米结构制剂的生物活性降低。研究人员描述了一种制备高生物活性ChNPs的替代方法，该方法既不使用交联剂也不封装农用化学品。

**1. 引言**
当前，基于纳米颗粒(Nanoparticles, NPs)的材料已在多个工业领域成功应用。壳聚糖(Chitosan, Ch)是一种线性氨基多糖，由D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-(1-4)-糖苷键连接而成，通过甲壳素脱乙酰化获得。壳聚糖纳米颗粒(Chitosan Nanoparticles, ChNPs)最早于1994年通过乳液法获得，随后开发了多种制备方法，其中离子凝胶化(Ionotropic Gelation)法因其操作简便性和高效性被广泛使用。该法利用壳聚糖质子化氨基与三聚磷酸钠(Sodium Tripolyphosphate, TPP)的多价阴离子之间的静电相互作用形成纳米颗粒。现有综述缺乏对纳米结构形成过程中关键方面的系统分析，尤其是氨基多糖的物理化学特性、试剂比例和交联条件对纳米颗粒平均粒径、粒径分布和zeta电位的影响。本综述系统分析了通过离子交联法制备ChNPs的最新进展、性能及其在农业生物技术中的潜在应用。

**2. 壳聚糖纳米颗粒的平均粒径**
ChNPs的平均粒径主要受溶液中质子化壳聚糖大分子链的统计构象、大分子链间的平均距离以及TPP添加量（氨基与磷酸根摩尔比，–NH₂/PO₄）影响。低分子量(Low Molecular Weight, LMW)壳聚糖可形成小于100 nm的稳定悬浮液，而高分子量(High Molecular Weight, HMW)壳聚糖易形成微米级聚集体。搅拌速度通常需控制在600–800 rpm以防止颗粒聚集。

**2.1 壳聚糖溶液、有机酸和离子交联试剂浓度的影响**
ChNPs的粒径通常随壳聚糖浓度(C_Ch)的增大而增大。低浓度下，TPP阴离子优先与同一大分子链的氨基结合，形成较小颗粒；高浓度下，相邻大分子链易发生交联，导致粒径增大。乙酸浓度(C_AcA)和TPP浓度(C_TPP)的调控可进一步优化粒径，例如，增加C_AcA可降低粒径和多分散指数(Polydispersity Index, PDI)，而过高C_TPP则导致微米级颗粒形成。有研究提出使用空间占有率C_Ch[η]（基于特性粘度[η]）来优化ChNPs粒径，但该方法的通用性尚需验证。

**2.2 壳聚糖脱乙酰度的影响**
脱乙酰度(Degree of Deacetylation, DD)决定壳聚糖大分子链上可质子化氨基的数量。高DD（低DA）提供更多正电荷，有利于与TPP交联，但增加DD可能增大ChNPs粒径。研究表明，DD在72–82%范围内可获得较小粒径的ChNPs。对于LMW壳聚糖，粒径对DD的依赖性较弱。

**2.3 [–NH₂]/[PO₄]比例的影响**
Ch:TPP体积比或质量比的变化影响ChNPs的粒径。存在一个最优比例（通常为3:1至5:1），在该比例下粒径最小且PDI较低。过高或过低的比例均会导致颗粒聚集或粒径增大。有研究采用中心复合设计(Central Composite Design)等方法优化制备条件，得到约100 nm的ChNPs。引入强中性盐（如NaCl）可压缩大分子链，减小粒径并提高稳定性。

**2.4 温度的影响**
温度通过影响TPP扩散速率、聚合物链柔性和溶解度来调控ChNPs粒径。有些研究表明，降低反应温度（如从70°C降至10°C）会导致粒径增大，而另一些研究则发现温度在4–30°C范围内对粒径影响不大，但在50°C时粒径显著增大。储存温度也影响ChNPs的稳定性，4°C和25°C下储存12个月粒径无明显变化，40°C下则发生降解。

**2.5 pH依赖性**
介质pH通过影响壳聚糖氨基质子化和TPP磷酸根离子化程度来调控ChNPs的粒径和稳定性。壳聚糖溶解通常需酸性介质（pH<6.0），调整初始壳聚糖溶液pH至4.5–5.5可减小大分子链溶胀，有利于形成小粒径ChNPs。TPP在pH 4.5–5.5范围内主要以三电荷阴离子(P₃O₁₀^5-)形式存在，与壳聚糖聚阳离子有效交联。pH高于6.5会导致壳聚糖去质子化并沉淀。在缓冲介质中，ChNPs的溶胀和降解行为受pH和离子强度控制，高离子强度可导致离子交联网络解离。

**3. ChNPs的粒径分布**
ChNPs的粒径分布受壳聚糖的分子量(Molecular Weight, MW)和DD、试剂浓度与比例、pH、温度及超声处理等因素影响。粒径分布通常随C_Ch增大和AA增加而向大粒径方向移动。优化Ch:TPP比例可获得窄分布（PDI<0.3），非优化比例下可能出现双峰分布。LMW壳聚糖有利于形成单分散纳米颗粒。有研究通过同时降低C_AcA和反应温度成功获得PDI<0.05的ChNPs。统计实验设计方法（如Box–Behnken）可高精度预测粒径。但文献中鲜有将粒径分布与壳聚糖的分子量分布相关联。

**4. ChNPs的zeta电位**
Zeta电位反映ChNPs的表面电荷，决定其聚集稳定性和生物活性。Zeta电位随C_Ch和MW增大而升高（+22至+55 mV），随TPP含量增加而降低。最优Ch:TPP比例下（3:1至6:1），zeta电位通常为+30至+45 mV，提供高胶体稳定性。pH影响氨基质子化程度，进而影响zeta电位：pH 4.5附近最低，pH低于4.0时因强质子化而升高，pH高于5.5时因去质子化而降低。引入NaCl可降低zeta电位但改善储存稳定性。反应时间延长会导致电荷重排和zeta电位逐渐稳定。部分研究中观察到负zeta电位（-3至-37 mV），可能因TPP过量导致电荷反转，但此类颗粒的生物活性尚未充分研究。

**5. 结论**
离子凝胶化法是制备ChNPs的常用方法，通常使用稀乙酸(pH 4.5–5.5)溶解壳聚糖，TPP浓度为0.01–1.0%，Ch:TPP比例在3:1–5:1。粒径可小至20 nm，zeta电位通常为正。但该方法存在固有缺陷：为压缩大分子链而对壳聚糖进行去质子化，以及TPP交联消耗质子化氨基，均会降低壳聚糖的生物活性。因此，多数研究通过封装农用化学品来弥补活性损失。为获得高生物活性的ChNPs，建议采用生物活性有机酸或氨基酸溶解壳聚糖，以保留更多质子化氨基。

**6. 未来方向**
针对离子凝胶化法的局限性，提出了两种替代策略：一是使用生物活性有机酸（如抗坏血酸、柠檬酸）或氨基酸（如谷氨酸、天冬氨酸）溶解壳聚糖，其阴离子可提供额外生物活性；二是避免使用交联剂，利用壳聚糖盐配合物的相分离自发形成纳米颗粒，例如壳聚糖天冬氨酸盐可形成50–80 nm的球形纳米颗粒，无需交联剂，且保留高阳离子电荷。此类颗粒经聚硅氧烷壳层包覆后可获得胶体稳定性，并已显示出抗真菌和促生长活性，在农业生物技术中具有应用前景。